[논문 리뷰] CRISPR/Cas9 For Photoactivated Localization Microscopy (PALM)

Yina Zhu, Pingchuan Li외 6명|arXiv (Cornell University)|2014. 03. 26.

Advanced biosensing and bioanalysis techniques인용 수 3

한 줄 요약

이 논문은 dCas9-mEos3.1 융합 단백질을 사용하여 지속적 유전자 요소를 고해상도로 사진 활성화 국소화 현미경(PALM)으로 관찰할 수 있는 CRISPR/Cas9 기반 시스템을 소개한다. 지침 RNA를 통해 dCas9를 특정 DNA 서열에 유도하고 mEos3.1의 광변환 특성을 활용함으로써, 이 방법은 내재된 반복 유전자 부위에서 염색체 구조를 고정밀도로 이미징할 수 있게 하여 고차원 염색체 조직 연구를 위한 새로운 도구를 제공한다.

ABSTRACT

We demonstrate that endonuclease deficient Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats CRISPR-associated Cas9 protein (dCas9) fused to the photo-convertible fluorescence protein monomeric mEos3.1 (dCas9-mEos3) can be used to resolve sub-diffraction limited features of repetitive gene elements, thus providing a new route to investigate high-order chromatin organization at these sites.

연구 동기 및 목표

• 생명세포 내 반복 유전자 요소를 고해상도로 이미징하는 방법을 개발하는 것.
• 기존 PALM 기술로는 내재된 반복 DNA 서열을 시각화하는 데 어려움이 있음을 극복하는 것.
• 유전자가 과발현되지 않도록 하면서도 내재된 부위에서 염색체 구조의 초해상도 국소화를 가능하게 하는 것.
• CRISPR/Cas9의 정밀한 타겟팅 특성을 활용하여 염색체 영역를 정확하게 표시하는 것.
• 반복 유전자 요소에서 고차원 염색체 조직을 연구할 수 있는 도구를 제공하는 것.

제안 방법

• 효소 활성이 없는 dCas9를 광변환 가능한 형광 단백질인 mEos3.1과 융합하여 유전자 부위를 정밀하게 표시할 수 있도록 하는 것.
• dCas9-mEos3.1을 특정 반복 DNA 서열(예: 시아토이드 반복 서열)에 유도하기 위해 지침 RNA(gRNA)를 설계하는 것.
• mEos3.1을 초록색에서 빨간색 형광으로 전환시키는 광활성화를 통해 PALM에서 단일 분자 국소화를 가능하게 하는 것.
• 전체 내부 반사 현미경(TIRF)을 사용하여 고공간 정밀도로 단일 광활성 mEos3.1 분자를 이미징하는 것.
• 단일 mEos3.1 분자를 순차적으로 광활성화하고 국소화하여 염색체 영역의 초해상도 이미지를 재구성하는 것.
• 통제 실험과 알려진 유전자 마커와의 비교를 통해 타겟팅 특이성을 검증하는 것.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 dCas9-mEos3.1를 사용하여 내재된 반복 유전자 요소의 초해상도 이미징이 가능할 수 있는가?
• RQ2 CRISPR/Cas9 시스템이 반복 염색체 부위에 대해 특이적이고 안정적인 mEos3.1 타겟팅을 가능하게 하는가?
• RQ3 광활성화된 mEos3.1는 생체 내 세포에서 초해상도 현미경에 필요한 충분한 신호 대 잡음 비율과 국소화 정밀도를 제공할 수 있는가?
• RQ4 dCas9-mEos3.1 집합체의 공간 분포는 반복 영역에서 알려진 염색체 조직 특성과 어떻게 비교되는가?
• RQ5 이 방법은 유전적 수정 없이 내재된 부위에서 고차원 염색체 구조를 연구하는 데 적용 가능한가?

주요 결과

• dCas9-mEos3.1 융합 단백질은 시아토이드 반복 서열과 같은 반복 유전자 요소를 높은 특이성으로 타겟팅하였다.
• 초해상도 이미징이 달성되어 내재된 반복 부위에서 나노미터 수준의 정밀도로 개별 집합체를 분간할 수 있었다.
• mEos3.1의 광활성화를 통해 단일 분자 국소화가 가능해져 염색체 구조의 초해상도 이미지 재구성이 가능해졌다.
• 이 방법은 과발현이나 내재적 태깅 없이도 내재된 부위에서 염색체 조직을 시각화할 수 있게 하였다.
• 통제 실험을 통해 표시가 gRNA와 기능성 dCas9에 의존한다는 것이 확인되어 특이성이 검증되었다.
• 여러 실험에서 생체 내 세포에서 반복 요소를 이미징하는 데 있어 이 시스템이 뛰어난 내구성과 재현 가능성을 보였다.