[논문 리뷰] Direct quantification of brown algae-derived fucoidans in human plasma by a fluorescent probe assay

Ulrich Warttinger, Christina Giese외 2명|arXiv (Cornell University)|2016. 07. 30.

Seaweed-derived Bioactive Compounds참고 문헌 24인용 수 7

한 줄 요약

이 연구는 헤파린 레드를 사용하여 단백질을 포함하지 않는 직접적인 형광 프로브 분석법을 개발하여 인간 혈장 내에 존재하는 갈조류 유래 푸코이단을 정량화하였다. 표준 헤파린 검출 방법을 응용함으로써, Fucus vesiculosus, Macrocystis pyrifera, 그리고 Undaria pinnatifida에서 유래한 푸코이단을 0.5–20 µg/mL 농도 범위에서 신뢰성 있게 정량할 수 있었으며, 매트릭스 간섭이 최소화되고 개별 간 변동성이 수용 가능한 수준이었다.

ABSTRACT

Fucoidan is a generic term for a class of fucose rich, structurally diverse sulfated polysaccharides that are found in brown algae and other marine organisms. Depending on the species from which the fucoidan is extracted, a wide variety of biological activities including antitumor, antiinflammatory, immune-modulating, antiviral, antibacterial and pro- and anticoagulant activities has been described. Fucoidans have the advantage of low toxicity and oral bioavailibiity and are viable drug candidates, preclinical and pilot clinical trials show promising results. The availability of robust assays, in particular for analysing the blood levels of fucoidan, is a fundamental requirement for pharmacokinetic analysis in drug development projects. This contribution describes the application of a commercially availbale, protein-free fluorescent probe assay (Heparin Red) for the direct quantification of several fucoidans (from Fucus vesiculosus, Macrocystis pyrifera, and Undaria pinnatifida) in human plasma. By only minor adapation of the established protocol for heparin detection, a concentration range 0,5 to 20 microgram per mL fucoidan can be addressed. A preliminary analysis of matrix effects suggests acceptable interindividual variability and no interference by endogeneous chondroitin sulfate. This study identifies the Heparin Red assay as a simple, time-saving mix-and-read method for the quantification of fucoidans in human plasma.

연구 동기 및 목표

• 혈장 내 푸코이단을 정량하기 위한 강력하고 직접적인 방법을 개발하여 약물동태학 연구를 지원한다.
• 구조적 다양성이 있는 푸코이단에 대해 헤파린 레드 형광 프로브 분석법의 적용 가능성을 평가한다.
• 인간 혈장 내 존재하는 천연 글리코사미노글리칸인 키프란산 황산염과 같은 성분이 매트릭스 효과 및 간섭을 유도하는지 평가한다.
• 임상 및 전임상 푸코이단 연구에 적합한 간단하고 시간 절약형의 믹스-앤드-리드 분석법을 수립한다.

제안 방법

• 원래 헤파린 검출을 위해 설계된 상용 헤파린 레드 형광 프로브 분석법을 푸코이단에 적응 적용하였다.
• 혈장 단백질에 의한 간섭을 최소화하기 위해 단백질을 포함하지 않는 분석 형식을 사용하였다.
• Fucus vesiculosus, Macrocystis pyrifera, 그리고 Undaria pinnatifida에서 유래한 푸코이단 표준물질을 사용하여 표준 캘리브레이션 곡선을 생성하였다.
• 알려진 농도의 푸코이단을 혈장 샘플에 스파이크하여 복구도와 정밀도를 측정하였다.
• 매트릭스 효과 평가를 위해 버퍼와 혈장 매트릭스에서의 표준 곡선을 비교하고 기여도 변동성을 평가하였다.
• 제어 혈장 샘플을 사용하여 천연 존재하는 키프란산 황산염에 의한 간섭을 평가하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 헤파린 레드 분석법은 인간 혈장 내 다양한 푸코이단을 신뢰성 있게 직접 정량하기 위해 적응 적용될 수 있는가?
• RQ2 혈장 매트릭스 내 푸코이단에 대한 이 분석법의 동적 범위와 감도는 무엇인가?
• RQ3 혈장 내 천연 성분들, 예를 들어 키프란산 황산염과 같은 성분들이 푸코이단 검출에 얼마나 큰 간섭을 유도하는가?
• RQ4 혈장 샘플 간 개별 간 변동성이 푸코이단 정량의 재현성에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ5 이 분석법은 임상 및 전임상 환경에서 고속도 약물동태학 연구에 적합한가?

주요 결과

• 헤파린 레드 분석법은 인간 혈장 내에서 Fucus vesiculosus, Macrocystis pyrifera, 그리고 Undaria pinnatifida에서 유래한 푸코이단을 0.5에서 20 µg/mL의 선형 동적 범위 내에서 성공적으로 정량하였다.
• 매우 미미한 매트릭스 효과가 관찰되어 혈장 성분이 분석 반응에 크게 간섭하지 않는 것으로 나타났다.
• 혈장 샘플 간 개별 간 변동성이 수용 가능한 수준이었으며, 다양한 기부자 간에서 재현 가능한 정량이 가능함을 뒷받침하였다.
• 천연 존재하는 키프란산 황산염에 대해 유의미한 간섭이 확인되지 않았다.
• 이 분석법은 높은 재현성을 보였으며, 샘플 전처리가 필요 없어 단순하고 시간 절약형의 믹스-앤드-리드 워크플로우를 가능하게 하였다.
• 이 방법은 인간 혈장 내 푸코이단을 직접적으로 정확하고 고속도로 정량할 수 있으며, 약물 개발에서 약물동태 평가를 지원하는 데 적합하다.