[논문 리뷰] Exploiting speckle correlations to improve the resolution of wide-field fluorescence microscopy

Hasan Yılmaz, E.G. van Putten외 4명|University of Twente Research Information|2014. 10. 08.

Random lasers and scattering media참고 문헌 28인용 수 55

한 줄 요약

이 논문은 갈륨 화 phosphide 산란 렌즈에서 유도된 스페클 패턴을 이용하여 광역 형광 현미경에서 초분산 한계 이하의 해상도를 달성하는 Speckle Correlation Resolution Enhancement (SCORE) 방법을 제안한다. 여러 기울인 빛 입사 각도에서 스페클 조명의 상관관계를 활용함으로써, 파형 보정 또는 복잡한 캘리브레이션 없이 10×10 µm² 영역에서 130 nm의 탈컨볼루션 해상도를 실현한다.

ABSTRACT

Fluorescence microscopy is indispensable in nanoscience and biological sciences. The versatility of labeling target structures with fluorescent dyes permits to visualize structure and function at a subcellular resolution with a wide field of view. Due to the diffraction limit, conventional optical microscopes are limited to resolving structures larger than 200 nm. The resolution can be enhanced by near-field and far-field super-resolution microscopy methods. Near-field methods typically have a limited field of view and far-field methods are limited by the involved conventional optics. Here, we introduce a combined high-resolution and wide-field fluorescence microscopy method that improves the resolution of a conventional optical microscope by exploiting correlations in speckle illumination through a randomly scattering high-index medium: Speckle correlation resolution enhancement (SCORE). As a test, we collect two-dimensional fluorescence images of 100-nm diameter dye-doped nanospheres. We demonstrate a deconvolved resolution of 130 nm with a field of view of 10 x 10 $ ext{μm}^2$.

연구 동기 및 목표

• 스캐닝 프로브나 특수 염료를 요구하지 않는 단순하고 하드웨어 없는 방법을 통해 광역 형광 현미경에서 분산 한계를 극복하는 것.
• 스페클 기반 영상에서 일반적으로 광학 기억 효과에 의해 제한되는 스페클 스캔 범위를 초월해 영역을 확장하는 것.
• 산란 매질의 사전 특성화나 복잡한 광학 제어 없이도 스페클 상관관계가 해상도 향상에 기여할 수 있음을 입증하는 것.
• 단지 간섭성 조명과 산란층만을 사용하여 기존 현미경 장비에서 200 nm 이하의 해상도를 달성하는 것.

제안 방법

• 561 nm 간섭성 레이저 빔을 갈륨 화 phosphide (GaP) 기판에 조사하여 표면에 존재하는 2 µm 두께의 다공성 산란층을 통해 스페클 패턴을 생성한다.
• 광학 기억 효과 범위 내에서 입사 빛을 기울여 (Δθ ≈ 1°), 표본 상의 스페클 패턴을 이동시켜 물체 평면에서 래스터 스캔을 구현한다.
• 고NA 목표렌즈 (NA = 0.95) 를 사용하여 형광 방출을 검출하고, R = λ_flu/(2NA) = 322 nm 의 해상도를 확보하며, 각 빛 기울임 각도에서 전장 영상을 촬영한다.
• 스페클 스캔 측정을 다수 병합하여 통계적 상관관계를 활용해 광역 영상 재구성을 위한 병렬 스페클 검출을 수행한다.
• 알려진 점함수확산함수를 이용해 재구성된 영상에 수치적 탈컨볼루션을 적용하여 진짜 물체 분포를 추출하고 해상도를 향상시킨다.
• 파형 보정 또는 투과 매트릭스 측정이 필요 없이, 빛 기울임 각도 간의 스페클 패턴 상관관계를 활용해 고해상도 정보를 추출한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 산란 매질 내 스페클 상관관계를 활용하여 광역 형광 현미경에서 분산 한계를 초월한 해상도 향상을 달성할 수 있는가?
• RQ2 스페클 기반 초해상도 영상에서 해상도를 유지하면서 영역을 얼마나 넓힐 수 있는가?
• RQ3 산란 매질의 사전 캘리브레이션 또는 복잡한 광학 제어 없이도 고해상도 영상 촬영이 가능한가?
• RQ4 기존 현미경 목표렌즈와 단순 산란 렌즈만을 사용한 실용적 구현에서 달성 가능한 해상도는 얼마인가?

주요 결과

• 10×10 µm² 영역에서 탈컨볼루션 해상도가 130 nm로 향상되어 기존 현미경의 해상도 한계를 크게 초월한다.
• 146 nm 중심 간격으로 떨어져 있는 두 개의 100-nm 지름 형광 나노입자가 SCORE 영상에서는 명확히 분리되어 보이지만, 기존 현미경에서는 하나의 해상도가 낮은 덩어리로 나타난다.
• 탈컨볼루션된 점함수확산함수의 반폭하강폭(FWHM)은 140 nm이며, 주어진 조명 빛 너비에 대한 이론적 한계인 116 nm와 매우 가깝다.
• 파형 보정, 투과 매트릭스 측정, 산란 매질의 사전 특성화 없이도 해상도 향상이 달성된다.
• 표본 이동이나 레이저 방향 변동에 대해 강건하며, GaP (n = 3.45) 에서 λ_ill = 550 nm 일 경우 해상도 한계가 약 80 nm까지 향상될 수 있다.
• 이론적 분석 결과, 구조화된 조명 현미경와 유사하게 조명 및 탐지 해상도 한계를 조합함으로써 해상도를 64 nm까지 향상시킬 수 있음을 보여준다.