[논문 리뷰] Fluorescence energy transfer enhancement in aluminum nanoapertures

Juan de Torres, Petru Ghenuche외 3명|arXiv (Cornell University)|2015. 04. 03.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 47인용 수 26

한 줄 요약

이 연구는 알루미늄 제로모드 웨이브가이드(ZMW)에서 푸르스터 공명 에너지 전달(FRET)을 정량화하며, FRET 속도가 기ating 감쇠 속도와 국소 광학 상태 밀도(LDOS)에 선형적으로 비례함을 보여준다. 알루미늄 ZMW는 녹색 스펙트럼 범위에서 손실이 적어 금보다 발광 브라이트니를 더 높게 만들며, 생리학적 마이크로몰 농도에서 단일 분자 FRET를 최소한의 FRET 효율 변화로 가능하게 한다.

ABSTRACT

Zero-mode waveguides (ZMWs) are confining light into attoliter volumes, enabling single molecule fluorescence experiments at physiological micromolar concentrations. Among the fluorescence spectroscopy techniques that can be enhanced by ZMWs, Förster resonance energy transfer (FRET) is one of the most widely used in life sciences. Combining zero-mode waveguides with FRET provides new opportunities to investigate biochemical structures or follow interaction dynamics at micromolar concentration with single molecule resolution. However, prior to any quantitative FRET analysis on biological samples, it is crucial to establish first the influence of the ZMW on the FRET process. Here, we quantify the FRET rates and efficiencies between individual donor-acceptor fluorophore pairs diffusing in aluminum zero-mode waveguides. Aluminum ZMWs are important structures thanks to their commercial availability and the large literature describing their use for single molecule fluorescence spectroscopy. We also compare the results between ZMWs milled in gold and aluminum, and find that while gold has a stronger influence on the decay rates, the lower losses of aluminum in the green spectral region provide larger fluorescence brightness enhancement factors. For both aluminum and gold ZMWs, we observe that the FRET rate scales linearly with the isolated donor decay rate and the local density of optical states (LDOS). Detailed information about FRET in ZMWs unlocks their application as new devices for enhanced single molecule FRET at physiological concentrations.

연구 동기 및 목표

• 단일 분자 연구를 위한 알루미늄 제로모드 웨이브가이드(ZMW)가 푸르스터 공명 에너지 전달(FRET)에 미치는 영향을 정량화하는 것.
• 플라스모닉 효과와 광학 손실을 중시하여 알루미늄 ZMW와 금 ZMW 간의 FRET 효율성과 동역학을 비교하는 것.
• 알루미늄 ZMW를 마이크로몰 농도에서 향상된 단일 분자 FRET 플랫폼으로 확립하는 것.
• 기여자 수명 감소와 발광 버스트 강도 분석이라는 두 가지 독립적인 방법을 사용해 FRET 측정을 검증하는 것.
• 플라스모닉 나노구조에서 FRET 속도를 조절하는 국소 광학 상태 밀도(LDOS)의 역할을 규명하는 것.

제안 방법

• 이중 DNA 리간드에 있는 기여자-수용체 형광체 간 FRET를 연구하기 위해 지름 120~385 nm 범위의 알루미늄 및 금 ZMW를 사용함.
• 확산 시간, 브라이트니, 검출 부피 감소를 측정하기 위해 광학 상관 분석(FCS)을 활용함.
• 시간에 따라 연계된 단일 광자 수명 측정(TCSPC)을 사용해 고립 상태와 FRET 억제 상태에서의 기여자 수명을 추출함.
• 두 가지 독립적인 방법을 사용해 FRET를 정량화함: (1) 에너지 전달로 인한 기여자 수명 감소, (2) 수용체 버스트 강도 분석.
• FCS 상관함수를 피팅하여 확산 시간, 트리플렛 분율, 번쩍임 시간, 발광 브라이트니 등의 파라미터를 추출함.
• 알루미늄 ZMW와 금 ZMW를 비교해 발광 브라이트니 향상 요인과 검출 부피 감소 요인을 계산함.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 알루미늄 ZMW에서 국소 광학 상태 밀도(LDOS)가 FRET 속도와 효율성에 미치는 영향은 무엇인가?
• RQ2 플라스모닉 금속 선택(알루미늄 대비 금)이 FRET 효율성과 발광 브라이트니 향상에 미치는 영향은 무엇인가?
• RQ3 ZMW는 전통적인 공형 렌즈 현미경에 비해 FRET 과정을 어느 정도 왜곡하는가?
• RQ4 비방사성 손실 측면에서 알루미늄 ZMW의 발광 감쇠 역학은 금 ZMW와 비교해 어떻게 다른가?
• RQ5 두 가지 독립적인 방법을 사용해 ZMW 내 FRET 측정을 신뢰성 있게 정량화할 수 있으며, 그 결과는 일관된가?

주요 결과

• 알루미늄 ZMW에서 FRET 속도는 고립된 기여자 감쇠 속도와 국소 광학 상태 밀도(LDOS)에 대해 선형적으로 비례하며, 이는 이론적 예측을 확인함.
• 190 nm 지름에서 알루미늄 ZMW는 금보다 3.3배 높은 발광 브라이트니 향상을 보이며, 녹색 스펙트럼 범위에서의 낮은 광학 손실 덕분임.
• 다양한 ZMW 지름과 농도(최대 4배)에서 FRET 효율은 거의 변화하지 않으며, N ≈ 16에 도달할 때까지 유의미한 편차가 관찰되지 않아 공간 평균 효과가 최소임을 시사함.
• 알루미늄 ZMW에서 기여자 발광 수명은 공형 렌즈에서의 약 3.0 ns에서 FRET 쌍에서 약 1.5–2.0 ns로 감소하여 약 50%의 에너지 전달 효율을 반영함.
• 금 ZMW는 금의 광발광으로 인해 약 5 ps의 빠른 보조 감쇠 성분을 보이며, 이는 알루미늄 ZMW에는 존재하지 않음.
• 플라스모닉 금속의 성능 지표(|Re(ε)|/|Im(ε)|)는 녹색 영역(~560 nm)에서 알루미늄이 금보다 뛰어나며, 알루미늄의 낮은 허수 부분이 손실을 줄임.