[논문 리뷰] High-resolution transport-of-intensity quantitative phase microscopy with annular illumination

Chao Zuo, Jiasong Sun외 4명|arXiv (Cornell University)|2017. 04. 13.

Digital Holography and Microscopy참고 문헌 92인용 수 13

한 줄 요약

이 논문은 전통적인 TIE 영상에서의 해상도 및 대비 제한을 극복하기 위해 고리형 조명 기반의 운반-강도 양자 위상 현미경(이하 AI-TIE)을 제안한다. 원형 조명을 목표 렌즈의 NA에 맞는 고리형 조명으로 대체함으로써, 저주파수 위상 대비를 향상시키고 횡방향 해상도를 208 nm로 향상시켰다—이에 해당하는 효과적 NA는 2.66이며, 이는 고정밀한 비침습적 생세포 영상 촬영이 가능하게 하며 광독성을 최소화하고 표준 밝은 영역 현미경과도 호환된다.

ABSTRACT

For quantitative phase imaging (QPI) based on transport-of-intensity equation (TIE), partially coherent illumination provides speckle-free imaging, compatibility with brightfield microscopy, and transverse resolution beyond coherent diffraction limit. Unfortunately, in a conventional microscope with circular illumination aperture, partial coherence tends to diminish the phase contrast, exacerbating the inherent noise-to-resolution tradeoff in TIE imaging, resulting in strong low-frequency artifacts and compromised imaging resolution. Here, we demonstrate how these issues can be effectively addressed by replacing the conventional circular illumination aperture with an annular one. The matched annular illumination not only strongly boosts the phase contrast for low spatial frequencies, but significantly improves the practical imaging resolution to near the incoherent diffraction limit. By incorporating high-numerical aperture (NA) illumination as well as high-NA objective, it is shown, for the first time, that TIE phase imaging can achieve a transverse resolution up to 208 nm, corresponding to an effective NA of 2.66. Time-lapse imaging of in vitro Hela cells revealing cellular morphology and subcellular dynamics during cells mitosis and apoptosis is exemplified. Given its capability for high-resolution QPI as well as the compatibility with widely available brightfield microscopy hardware, the proposed approach is expected to be adopted by the wider biology and medicine community.

연구 동기 및 목표

• 원형 조명을 사용하는 부분적으로 간섭성 운반-강도 양자 위상 영상(TIE-QPI)에서 내재된 노이즈 대 해상도 간 상충 관계와 낮은 위상 대비 문제를 해결하기 위해.
• 복잡한 광학 장치나 시간적 간섭성을 요구하지 않고도, 비편광 조명을 활용해 TIE-QPI의 횡방향 해상도를 비편광 회절 한계에 가깝게 향상시키기 위해.
• 특히 미토시스와 프로그램된 세포 사멸과 같은 동적 과정을 관찰할 수 있도록 고정밀, 저노이즈, 비광독성의 시간 분해 영상 촬영을 가능하게 하기 위해.
• 기존의 밝은 영역 현미경 하드웨어, 즉 텅스텐 램프와 코흐러 조명을 포함하여 광범위한 생물학적 및 의학적 연구 분야에서의 보급을 가능하게 하기 위해.

제안 방법

• 표준 원형 조명 조리개를 목표 렌즈의 수치적 열(AP)에 맞는 고리형 조리개로 대체하여 조명 소스 함수를 형상화하고 목표 렌즈의 NA와 일치시킴.
• 고수치 렌즈(NA) 오일 잠김 목표 렌즈와 고리형 조명을 활용해 효과적 NA 2.66를 달성함으로써 비편광 회절 한계에 가까워짐.
• 다양한 축 방향의 오프셋 위치에서의 강도 측정값을 기반으로 운반-강도 방정식(TIE)을 사용해 양자 위상 회복을 수행함.
• 부분적으로 간섭성 전달함수(WOTF)를 활용해 시스템 반응을 모델링하고, 고리형 조명을 통해 저주파수 및 고주파수 위상 대비 향상을 위한 주파수 커버리지 최적화.
• 고NA 조명 및 탐지 기술을 통합하여 해상도 향상과 스펙클 노이즈 억제를 달성함으로써 스펙클이 없는 안정적인 위상 재구성 가능.
• 50 ms 노출 및 1 프레임/초 촬영 속도로 시간 분해 영상 촬영을 수행하여 동적 세포 과정을 캡처하고, 정량적 위상 맵에서 위상 대비 및 DIC 영상 생성.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 고리형 조명은 기존의 원형 조명 대비 AI-TIE 기반의 양자 위상 영상에서 위상 대비와 해상도를 크게 향상시킬 수 있는가?
• RQ2 맞춤형 소스 분포를 가진 부분적으로 간섭성 조명을 사용할 경우, TIE-QPI는 비편광 회절 한계에 가까운 해상도를 얼마나 달성할 수 있는가?
• RQ3 고NA 고리형 조명 사용이 생세포 위상 영상에서 노이즈 성능과 영상 정밀도에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ4 AI-TIE는 전용 레이저나 복잡한 간섭계 장치 없이도 표준 밝은 영역 현미경에서 구현 가능한가?
• RQ5 이 방법은 미토시스와 프로그램된 세포 사멸과 같은 세포 내 동적 과정을 고해상도 및 저광독성으로 해상할 수 있는가?

주요 결과

• AI-TIE는 횡방향 해상도 208 nm를 달성하였으며, 이에 해당하는 효과적 수치적 열(AP)은 2.66로 현재까지 보고된 바에서 가장 높은 TIE 기반 양자 위상 영상 해상도이다.
• 저주파수 성분에 대한 위상 대비가 크게 향상되어 기존 TIE 영상에서 흔히 발생하는 저주파수 아티팩트를 감소시켰다.
• 위상 노이즈가 최소화되었으며, 비세포 영역에서 360회의 독립 측정의 표준 편차는 단지 1.81 pg에 불과하여 높은 안정성과 낮은 노이즈를 나타낸다.
• in vitro 헬라 세포의 시간 분해 영상 촬영 결과, 미토시스 및 프로그램된 세포 사멸 과정에서 핵의 응집, 세 cytoplasmic 응집, 세포막 볼블링, 조기 세포 사멸체 형성 등의 명확한 형태학적 변화가 관찰되었다.
• 기존의 밝은 영역 현미경 하드웨어, 즉 텅스텐 램프와 코흐러 조명을 포함하여 광범위한 생물학적 및 의학적 실험실에서의 보급이 가능하다.
• 현재 영상 속도는 기계적 z-스캐닝에 의해 제한되어 있어 1 프레임/초이지만, 공간 광학 조절 장치 또는 전기적으로 조절 가능한 렌즈를 사용해 영상 속도로 가속화가 가능할 것이다.