[논문 리뷰] In silico design, in vitro construction and in vivo application of synthetic small regulatory RNAs in bacteria

Martin Brueck, Bork A. Berghoff외 1명|arXiv (Cornell University)|2023. 04. 28.

Bacterial Genetics and Biotechnology참고 문헌 19인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 SEEDling을 이용한 시뮬레이션 예측, 골든 게이트 클로닝을 통한 인 비트로 조립, 그리고 표현형 스크리닝 또는 형광 레포트 시스템을 통한 기능 검증을 통해 박테리아에서 합성된 소규모 조절 RNA(sRNA)의 설계, 구축 및 검증을 위한 간소화된 파이프라인을 제시한다. 이 방법은 *E. coli*에서 acrA mRNA의 억제에 성공하여 옥사실린에 대한 민감도 증가를 통해 sRNA의 기능성을 확인하였다.

ABSTRACT

Small regulatory RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs in bacteria capable of post-transcriptional regulation. sRNAs have recently gained attention as tools in basic and applied sciences for example to fine-tune genetic circuits or biotechnological processes. Even though sRNAs often have a rather simple and modular structure, the design of functional synthetic sRNAs is not necessarily trivial. This protocol outlines how to use computational predictions and synthetic biology approaches to design, construct and validate synthetic sRNA functionality for their application in bacteria. The computational tool, SEEDling, matches the optimal seed region with the user-selected sRNA scaffold for repression of target mRNAs. The synthetic sRNAs are assembled using Golden Gate cloning and their functionality is subsequently validated. The protocol uses the acrA mRNA as an exemplary proof-of-concept target in Escherichia coli. Since AcrA is part of a multidrug efflux pump, acrA repression can be revealed by assessing oxacillin susceptibility in a phenotypic screen. However, in case target repression does not result in a screenable phenotype, an alternative validation of synthetic sRNA functionality based on a fluorescence reporter is described.

연구 동기 및 목표

• 박테리아에서 功能적인 합성 sRNA를 설계하기 위한 신뢰성 있고 모듈화된 파이프라인을 개발하기 위해.
• 단순한 모듈식 구조에도 불구하고 sRNA 설계가 비직관적이라는 도전 과제를 해결하기 위해.
• 합성 생물학 및 생물공학 분야에서 정밀한 번역 후 유전자 조절을 가능하게 하기 위해.
• 표현형 스크리닝과 형광 레포트 시스템을 대체 검증 방법으로 사용하는 검증된 워크플로우를 제공하기 위해.

제안 방법

• 사용자가 선택한 sRNA 스카피드와 목표 mRNA 억제에 적합한 최적의 시드 영역을 예측하기 위해 SEEDling 컴퓨팅 도구를 활용한다.
• 시뮬레이션 예측을 통해 특정 mRNAs를 타겟으로 하는 정의된 시드 서열을 가진 합성 sRNA 구조를 설계한다.
• 고정밀도, 모듈식, 효율적인 인 비트로 구축을 위해 골든 게이트 클로닝을 사용하여 합성 sRNA를 조립한다.
• *Escherichia coli*에 변형하여 인 비보 발현 및 기능 테스트를 수행한다.
• acrA 억제가 다중 약물 배출 펌프를 손상시키므로, 옥사실린 내성 테스트를 통해 표현형 스크리닝을 통한 sRNA 기능 검증을 수행한다.
• 관찰 가능한 표현형이 없을 경우, 형광 레포트 시스템을 대체 검증 방법으로 사용한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 SEEDling과 같은 시뮬레이션 예측 도구는 특정 mRNAs를 타겟으로 하는 합성 sRNA의 기능적 시드 영역을 신뢰성 있게 식별할 수 있는가?
• RQ2 골든 게이트 클로닝은 높은 정밀도와 모듈성을 갖춘 합성 sRNA의 조립에 효과적인가?
• RQ3 acrA mRNA의 억제가 옥사실린 내성 테스트를 통한 표현형 스크리닝으로 감지될 수 있는가?
• RQ4 관찰 가능한 표현형 출력이 없을 경우 sRNA의 기능은 어떻게 검증할 수 있는가?
• RQ5 형광 레포트 시스템은 표현형 스크리닝의 신뢰할 수 있는 대체 방법이 될 수 있는가?

주요 결과

• SEEDling 도구는 *E. coli*에서 acrA mRNA 타겟의 효과적 억제를 가능하게 하는 기능적 시드 영역을 성공적으로 식별하였다.
• 골든 게이트 클로닝은 고정밀도와 고모듈성으로 합성 sRNA 유전자를 효율적이고 정확하게 인 비트로 조립하는 데에 기여하였다.
• acrA mRNA의 억제는 옥사실린 내성 증가를 초래하여 표현형 스크리닝을 통한 기능적 sRNA 활성의 확인이 이루어졌다.
• 표현형 출력이 없을 경우, 형광 레포트 시스템이 sRNA 기능성 검증을 위한 신뢰할 수 있는 대체 방법을 제공하였다.
• acrA를 증명용 타겟으로 사용하여, 시뮬레이션 설계에서 인 비보 검증에 이르는 전체 파이프라인은 성공적으로 구현되었다.