[논문 리뷰] Leveraging massively parallel reporter assays for evolutionary questions

Irene Gallego Romero, Amanda J. Lea|arXiv (Cornell University)|2022. 04. 12.

Genetic diversity and population structure인용 수 6

한 줄 요약

이 논문은 종 간 진화적 변화에서 비코딩 조절 서열의 역할을 규명하기 위해 다량의 병렬 보고자 시험(MPRAs)의 사용을 주장한다. 한 번의 실험에서 수천에서 수백만 개의 조절 서열을 고 throughput으로 기능 테스트할 수 있기 때문에 MPRAs는 기존의 확장성과 비모델 생물에의 적용성에 대한 한계를 극복하며, 게놈 규모의 기능적 진화 유전학에 강력한 도구를 제공한다.

ABSTRACT

A long-standing goal of evolutionary biology is to decode how gene regulatory processes contribute to organismal diversity, both within and between species. This question has remained challenging to answer, due both to the difficulties of predicting function from non-coding sequence, and to the technological constraints of laboratory research with non-model taxa. However, a recent methodological development in functional genomics, the massively parallel reporter assay (MPRA), makes it possible to test thousands to millions of sequences for regulatory activity in a single in vitro experiment. It does so by combining traditional, single-locus episomal reporter assays (e.g., luciferase reporter assays) with the scalability of high-throughput sequencing. In this perspective, we discuss the execution, advantages, and limitations of MPRAs for research in evolutionary biology. We review recent studies that have made use of this approach to address explicitly evolutionary questions, highlighting study designs that we believe are particularly well-positioned to gain from MPRA approaches. Additionally, we propose solutions for extending these powerful assays to rare taxa and those with limited genomic resources. In doing so, we underscore the broad potential of MPRAs to drive genome-scale functional evolutionary genetics studies in non-traditional model organisms.

연구 동기 및 목표

• 비코딩 DNA 서열과 조절 기능을 진화 생물학에서 연결 짓는 데 도전 과제를 해결하기 위해.
• 유전적 자원이 제한된 비모델 분류군에서 조절 요소를 테스트하는 데 있어 기술적 한계를 극복하기 위해.
• MPRA를 이용해 진화적 질문에 대해 게놈 전체 수준으로 기능적 시험을 확장할 수 있도록 보여주기 위해.
• 유전적 도구가 제한된 희귀하거나 잘 특성화되지 않은 종에 MPRA를 적용하기 위한 실용적 해결책을 제안하기 위해.
• 비伝통적 모델 생물에서 대규모 기능적 진화 유전학을 위해 MPRA를 전환적 도구로 위치지키기 위해.

제안 방법

• 다량의 병렬 보고자 시험(MPRAs)을 활용하여, 에피소말 보고자 시스템과 고 throughput 시퀀싱을 조합해 조절 활성을 테스트한다.
• 다양한 종으로부터 수천에서 수백만 개의 비코딩 DNA 서열을 포함한 합성 라이브러리를 설계한다.
• MPRA를 차세대 시퀀싱과 통합하여, 한 번의 in vitro 실험에서 각 서열 변형의 전사 활성을 정량화한다.
• 보존된 조절 기능과 종 간 호환성을 활용하여, 비모델 생물에서의 MPRA 프로토콜을 적응시킨다.
• MPRA 시퀀스 수를 정규화하고 해석하기 위해 생물정보학 파이프라인을 적용한다.
• 유전적 도구가 제한된 분류군에서의 MPRA 적용 전략을 제안하며, 이를 위해 in vitro 전이 및 합성 프로모터 설계를 포함한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 어떻게 비모델 생물에서 유래한 조절 서열을 대규모로 기능 테스트하여 그들의 진화적 역할을 이해할 수 있는가?
• RQ2 감도와 재현성을 극대화하기 위해 진화 연구에서 MPRA 실험의 핵심 설계 원칙은 무엇인가?
• RQ3 유전적 자원과 분자 자원이 제한된 희귀하거나 잘 특성화되지 않은 종에 MPRA를 어떻게 적응시킬 수 있는가?
• RQ4 MPRA 데이터는 서로 다른 진화적 계통 간에 cis-조절 활성을 얼마나 잘 예측할 수 있는가?
• RQ5 MPRA를 비교 게놈학과 통합하여 진화적 맥락에서 기능적으로 중요한 조절 요소를 식별할 수 있는가?

주요 결과

• MPRAs는 한 번의 실험에서 수만에서 수백만 개의 조절 서열을 기능 테스트할 수 있어, 기존의 보고자 시험보다 훨씬 높은 처리 능력을 제공한다.
• MPRA 데이터는 모델 시스템에서 내재된 유전자 발현 패tern과 강한 상관관계를 보이며, 이는 조절 요소 예측에 대한 그 유효성을 검증한다.
• 전이 조건 최적화와 보존된 프로모터 요소 사용을 통해, 비모델 생물에 대한 MPRA의 적용 가능성이 높아진다.
• MPRA는 종 간 동일한 기능을 수행하는 조절 서열 간의 미세한 기능적 차이를 감지할 수 있으며, 이는 유전자 조절의 진화적 변화를 드러낸다.
• MPRA를 비교 게놈학과 조합함으로써, 연구자들은 진화 분석을 위한 기능적으로 중요한 비코딩 변이를 우선순위 정할 수 있다.
• 저자는 유전적 자원과 분자 자원이 제한된 분류군에 MPRA를 적용하기 위한 실현 가능한 워크플로우를 제안하며, 이는 모델 시스템을 넘어서 그 활용도를 넓힌다.