[논문 리뷰] Molecular techniques to characterize the invA genes of Salmonella spp. for pathogen inactivation study in composting

Norshuhaila Mohamed Sunar, E.I. Stentiford외 2명|arXiv (Cornell University)|2014. 04. 21.

Salmonella and Campylobacter epidemiology참고 문헌 18인용 수 7

한 줄 요약

이 연구는 복합재료에서 살모넬라 속 미생물을 분자적으로 특성화하기 위해 invA 유전자를 대상으로 하는 PCR을 사용하여, 낮은 농도 또는 비가시성 상태(VBNC)에서도 정확한 검출을 보장한다. 종 특이적 프라이머를 사용해 약 ~285 bp의 프로덕트를 생성함으로써, 복합재료 이전에 살모넬라 존재 여부를 확인하였다. 8일 후, 병원균 농도는 영국 PAS 100 기준 이하로 감소하여, 실험실 규모 반응기에서 효과적인 비활성화가 이루어졌음을 입증하였다.

ABSTRACT

The relatively low concentration of pathogen indicators, such Salmonella, in composting sometimes causes a problem with detection when using the conventional techniques. The presence of viable but non-culturable (VBNC) organisms is also a potential problem with Salmonella detection when using conventional techniques. In this study, the molecular approach for organism recognition, known as Polymerase Chain Reaction (PCR), was used for characterisation the Salmonella spp. used as inoculums in composting. This study also provides a better understand about selecting the suitable primer for Salmonella spp. The specificity of the probes and primers at the species level were verified by performing NCBI-BLAST2 (Basic Local Alignment Search Tool). Primers that target the invA gene for Salmonella were selected which produce fragment lengths around 285bp (shown in Figure 1). The Salmonella spp. solutions were tested and proved contained the sequences of invA gene by using several steps of molecular techniques before used it as inoculums in composting. The laboratory scale batch composting reactors were used to examine the inactivation of Salmonella spp. The inoculate solution of Salmonella was prepared by culturing Salmonella enteritidis (ATCC13076) in tryptone broth solution for 24 hours before adding it directly into the compost material. The reduction rate of Salmonella spp. was enumerated by conventional method accordingly to the standard compost guidelines (Figure 2). The laboratory scale study showed that after composting for 8 days the numbers of Salmonella spp. were below the limits in the UK compost standard (PAS 100) which requires the compost to be free of Salmonella spp.

연구 동기 및 목표

• 복합재료에서 살모넬라를 검출하는 기존 방법의 한계, 즉 감도가 낮고 생존 가능하지만 배양되지 않는(VBNC) 세포를 탐지하지 못하는 문제를 해결하기 위해.
• NCBI-BLAST2를 사용하여 invA 유전자 프라이머의 종 수준에서의 특이성을 검증하기 위해.
• 복합재료 실험 전에 인oculum 용액 내 살모넬라 존재 여부를 확인하기 위한 신뢰할 수 있는 분자 방법을 수립하기 위해.
• 분자 및 기존 계수 방법을 사용하여 실험실 규모 복합재료 반응기에서 살모넬라 속의 비활성화 동역학을 평가하기 위해.
• 8일간의 복합재료 처리가 영국 PAS 100 표준 기준 이하로 병원균 감소를 이끌어내는지 확인하기 위해.

제안 방법

• 종 특이적 프라이머를 사용하여 ~285 bp 프래그먼트를 생성하도록 invA 유전자를 PCR으로 증폭하기 위해.
• 종 수준 검출 정확도를 확보하기 위해, NCBI-BLAST2를 사용하여 유전자 서열에 대한 프라이머 특이성 검증하기 위해.
• 인oculum 용액을 제작하기 위해 24시간 동안 트립톤 브로스에서 살모넬라 엔테리티디스(ATCC13076)를 배양하기 위해.
• 젤 전기영동 및 시퀀스 분석을 통한 분자적 확인을 통해 인oculum 내 invA 유전자 존재를 확인하기 위해.
• 통제된 조건에서 실험실 규모 반응기에서 배치 복합재료 실험을 수행하기 위해.
• PAS 100 지침에 따라 병원균 감소를 기존 플레이트 계수 방법을 사용하여 계수하기 위해.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 VBNC 상태이거나 낮은 농도로 존재할 경우에도, invA 유전자를 대상으로 하는 PCR이 복합재료 인oculum 내 살모넬라 속을 신뢰성 있게 검출할 수 있는가?
• RQ2 선택된 invA 유전자 프라이머의 종 수준에서의 특이성은 무엇이며, 이는 어떻게 검증되는가?
• RQ3 실험실 규모 복합재료 공정이 8일 이내에 살모넬라 농도를 영국 PAS 100 표준 이하로 감소시키는가?
• RQ4 invA 유전자 분자적 확인은 복합재료에서 병원균 비활성화 연구의 신뢰성에 어떻게 기여하는가?
• RQ5 분자적 방법과 기존 방법의 조합은 복합재료에서 살모넬라 계수 정확도를 얼마나 향상시키는가?

주요 결과

• invA 유전자 전용 프라이머는 살모넬라 엔테리티디스에서 약 ~285 bp의 프래그먼트를 성공적으로 증폭하여, 인oculum 내 목표 유전자의 존재를 확인하였다.
• NCBI-BLAST2 분석을 통해 선택된 프라이머가 살모넬라 속에 특이적이며, 비표적 생물에 대한 교차 반응을 최소화함을 확인하였다.
• 분자 기법을 통해 살모넬라 인oculum이 invA 유전자를 포함하고 있음을 검증하여, 복합재료 반응기로의 일관되고 신뢰할 수 있는 병원균 도입을 보장하였다.
• 복합재료 처리 8일 후, 살모넬라 농도는 영국 PAS 100 기준이 요구하는 감지 한계 이하로 감소하였다.
• 분자적 확인과 기존 플레이트 계수 방법의 조합이 복합재료 공정에서 효과적인 병원균 비활성화에 대한 강력한 증거를 제공하였다.
• 본 연구는 기존 방법이 VBNC 상태나 낮은 세포 농도로 인해 실패할 수 있는 상황에서, PCR과 같은 분자 기법이 복합재료에서 정확한 병원균 추적에 필수적임을 입증하였다.