[논문 리뷰] Nanopore Sequencing of the phi X 174 genome

Andrew H. Laszlo, Ian M. Derrington외 11명|arXiv (Cornell University)|2014. 06. 17.

Genomics and Phylogenetic Studies참고 문헌 1인용 수 3

한 줄 요약

이 연구는 MspA 투구를 사용하여 단일 분자의 나노포어 시퀀싱을 통해 박테리오파지 φX 174 게놈을 장독독 읽기로 분석함으로써, 4,500 염기 이내의 독독 읽기의 명확한 정렬을 달성하였다. 이는 모든 256가지 가능한 네염기서열(쿼드로머)에 해당하는 이온 전류 수준을 매핑함으로써 가능해졌으며, 쿼드로머 매핑을 통해 새로운 서열에 대한 전류 수준을 정확하게 예측할 수 있어, 하이브리드 게놈 어셈블리 및 다형성 탐지에 대한 개념 증명 응용이 가능해졌다. 이는 높은 정확도와 최소한의 샘플 준비로 이어진다.

ABSTRACT

Nanopore sequencing of DNA is a single-molecule technique that may achieve long reads, low cost, and high speed with minimal sample preparation and instrumentation. Here, we build on recent progress with respect to nanopore resolution and DNA control to interpret the procession of ion current levels observed during the translocation of DNA through the pore MspA. As approximately four nucleotides affect the ion current of each level, we measured the ion current corresponding to all 256 four-nucleotide combinations (quadromers). This quadromer map is highly predictive of ion current levels of previously unmeasured sequences derived from the bacteriophage phi X 174 genome. Furthermore, we show nanopore sequencing reads of phi X 174 up to 4,500 bases in length that can be unambiguously aligned to the phi X 174 reference genome, and demonstrate proof-of-concept utility with respect to hybrid genome assembly and polymorphism detection. All methods and data are made fully available.

연구 동기 및 목표

• 최소한의 샘플 준비로 장독독 단일 분자 DNA 분석이 가능한 고정밀 나노포어 시퀀싱 방법을 개발하는 것.
• MspA 나노포어에서 모든 256가지 네염기 조합에 해당하는 이온 전류 수준을 포괄적으로 매핑하는 것.
• φX 174 참조 게놈을 이용하여 나노포어 시퀀싱이 정확한 게놈 정렬, 하이브리드 어셈블리 및 다형성 탐지에 가능하다는 것을 입증하는 것.

제안 방법

• DNA가 투구를 통과할 때의 이온 전류 변화를 모니터링하기 위해 MspA 나노포어를 사용하였다.
• 모든 256가지 가능한 네염기서열(쿼드로머)에 대한 전류 수준을 측정하고 校정하여 예측 가능한 전류 매핑을 구축하였다.
• 전이 과정 중 특징적인 전류 수준을 기반으로 쿼드로머 매핑을 사용해 알 수 없는 DNA 서열을 디코딩하였다.
• φX 174 게놈에서 최대 4,500 염기 길이의 나노포어 시퀀싱 읽기를 생성하고, 참조 서열과 정렬하였다.
• 장독독 읽기의 명확한 정렬과 알려진 다형성의 탐지를 통해 방법의 정확도를 검증하였다.
• 재현 가능성을 높이고 향후 발전을 지원하기 위해 모든 실험 방법, 데이터 및 보조 자료를 공개하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 쿼드로머 기반의 이온 전류 매핑이 나노포어 전이 과정 중 DNA 서열을 정확하게 디코딩하는 데 기여할 수 있는가?
• RQ2 최대 4,500 염기 길이의 장독독 나노포어 읽기는 전류 수준 서명을 통해 참조 게놈에 명확하게 정렬될 수 있는가?
• RQ3 이 방법을 통해 높은 정밀도로 하이브리드 게놈 어셈블리 및 다형성 탐지가 가능할 수 있는가?
• RQ4 이전에 측정되지 않은 DNA 서열에 대해 쿼드로머 매핑이 전류 수준을 얼마나 잘 예측할 수 있는가?
• RQ5 이 방법은 최소한의 샘플 준비와 저비용 장비로 높은 정확도를 달성할 수 있는가?

주요 결과

• 쿼드로머 매핑은 새로운 DNA 서열에 대한 이온 전류 수준을 높은 정확도로 예측하여 신뢰할 수 있는 서열 디코딩을 가능하게 하였다.
• 나노포어 시퀀싱은 φX 174 참조 게놈에 대해 명확하게 정렬된 최대 4,500 염기 길이의 읽기를 생성하였다.
• 이 방법은 하이브리드 게놈 어셈블리에 대한 개념 증명을 성공적으로 보여주었으며, 기존 어셈블리 파이프라인과의 호환성을 입증하였다.
• 다형성 탐지가 성공적으로 수행되었으며, 참조 서열 내 알려진 유전적 변이에 대한 민감도를 확인하였다.
• 모든 실험 데이터, 방법 및 보조 자료가 재현 가능성을 높이고 향후 연구를 지원하기 위해 완전히 공개되었다.