[논문 리뷰] Pore lifetimes in cell electroporation: Complex dark pores?

James C. Weaver, P. Thomas Vernier|arXiv (Cornell University)|2017. 08. 24.

Microbial Inactivation Methods참고 문헌 18인용 수 11

한 줄 요약

이 논문은 전기영동에서 일시적인 순수 지질성 구멍의 장기적인 모델을 도전하며, 분자 동역학 시뮬레이션을 통해 이러한 구멍이 펄스 후 약 ~2 μs 이내에 사라진다고 주장한다. 대신 장수명의 복잡한 구멍—지질과 다른 분자들이 조합된 것—이 지속적인 펄스 후 이온 및 분자 이동을 담당할 수 있으며, 이는 구조적으로 알려져 있지 않은 '다크' 상태이지만 실험적 증거에 의해 존재가 뒷받침되며 수백 초에 이르는 수명을 가진다.

ABSTRACT

We review some of the basic concepts and the possible pore structures associated with electroporation (EP) for times after electrical pulsing. We purposefully give only a short description of pore creation and subsequent evolution of pore populations, as these are adequately discussed in both reviews and original research reports. In contrast, post-pulse pore concepts have changed dramatically. For perspective we note that pores are not directly observed. Instead understanding of pores is based on inference from experiments and, increasingly, molecular dynamics (MD) simulations. In the past decade concepts for post-pulse pores have changed significantly: The idea of pure lipidic transient pores (TPs) that exist for milliseconds or longer post-pulse has become inconsistent with MD results, which support TP lifetimes of only $\sim$100 ns. A typical large TP number during cell EP pulsing is of order $10^6$. In twenty MD-based TP lifetimes (2 us total), the TP number plummets to $\sim$0.001. In short, TPs vanish 2 us after a pulse ends, and cannot account for post-pulse behavior such as large and relatively non-specific ionic and molecular transport. Instead, an early conjecture of complex pores (CPs) with both lipidic and other molecule should be taken seriously. Indeed, in the past decade several experiments provide partial support for complex pores (CPs). Presently, CPs are "dark", in the sense that while some CP functions are known, little is known about their structure(s). There may be a wide range of lifetimes and permeabilities, not yet revealed by experiments. Like cosmology's dark matter, these unseen pores present us with an outstanding problem.

연구 동기 및 목표

• 최신 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 바탕으로 전기영동 펄스 이후 지질성 구멍의 지속 가능성 재평가.
• 관측된 장수명의 펄스 후 밀도성과 순수 지질성 구멍이 예측하는 짧은 수명(~100 ns) 사이의 모순을 해결.
• 지질과 다른 분자들이 조합된 복잡한 구멍이 지속적인 밀도성을 뒷받침할 수 있음을 제안하며, 직접적인 구조적 특성화가 부족함에도 불구하고.
• 실험적 및 시뮬레이션 증거를 통합하여 장수명의 기능적 활성 구멍이 순수 지질이 아닌 구조임을 시사함.

제안 방법

• 순수 지질성 구멍의 붕괴에 대한 의미 있는 자유 에너지 장벽이 없음을 보여주는 분자 동역학(MD) 시뮬레이션 분석으로, 빠른 구멍 붕괴를 암시함.
• 순수 지질성 구멍의 예측된 일시적 구멍(TP) 수명(~100 ns)과 실험적 펄스 후 복구 시간(최대 180 s)을 비교하여 모순을 규명함.
• 플레인 밸리어, 세포, 펄스 트레인 실험에서의 실험 데이터를 통합하여 1초 내외의 지연된 밀도성과 재봉합을 관찰함.
• 전도도, 이온 유입(Ca²⁺, 프로피디움), 캘세인 방출 측정을 통해 펄스 후 구멍 행동을 유추함.
• 0.1 s 간격의 펄스 간격을 가진 펄스 트레인 실험을 통해 복구 및 재형성된 구멍을 유추함.
• 전기생리학적 및 용질 이동 데이터를 해석하여 장수명의 비확산성 이동 경로 존재를 추론함.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 왜 실험 측정치는 전기영동 펄스 후 수 초간 지속적인 세포막 밀도성을 보이지만, 분자 동역학 시뮬레이션은 순수 지질성 구멍의 수명이 약 ~100 ns 뿐이라고 예측하는가?
• RQ2 순수 지질성 일시적 구멍의 예측 수명인 약 ~2 μs를 초월해 지속할 수 있는 구조적 및 에너지적 특성들은 무엇인가?
• RQ3 MD 시뮬레이션에서 검출되지 않는 순수 지질성 구멍이 없는 상황에서, 180 s에 이르는 재봉합 시간 스케일을 관찰한 실험적 관측치는 어떻게 설명할 수 있는가?
• RQ4 장수명의 비지질성 복잡한 구멍이 지속적인 밀도성을 매개할 수 있음을 뒷받침하는 증거는 무엇인가?
• RQ5 활성 이동 메커니즘 또는 전기역학 효과가 펄스 후 용질 이동에 기여한다면, 이는 안정된 구멍 유사 구조의 존재를 시사하는가?

주요 결과

• 분자 동역학 시뮬레이션은 순수 지질성 일시적 구멍이 붕괴에 대한 의미 있는 자유 에너지 장벽이 없음을 보여주며, 이는 약 ~100 ns의 수명 예측과 함께 빠른 붕괴를 암시함.
• 약 10⁶개의 일시적 구멍 집단이 ~0.001개로 감소하는 데 소요되는 총 시간은 약 ~2 μs로 추정되어, 펄스 후 수 마이크로초 내에 완전히 사라짐을 시사함.
• 세포막 재봉합 및 복구 시간 스케일에 대한 실험 측정치는 0.01 s에서 180 s까지 다양하며, 순수 지질성 구멍의 예측 수명보다 훨씬 길다.
• 0.1 s 간격의 펄스 트레인 실험에서 새로운 구멍이 형성됨을 관찰하여, 구멍 수와 세포막 전도도가 100 ms 내에 상당히 복구됨을 시사함.
• 펄스 후 100~1800 s의 지연된 밀도성 증가가 관찰되어, 장수명의 비확산성 이동 경로 존재를 암시함.
• 정지된 전위 조건 하에서의 용질 이동 증거는 확산과 전기역학 모두가 이동에 기여함을 시사하며, 이는 일시적 구멍 수명을 훨씬 초월해 지속되는 안정된 장수명의 구멍 유사 구조가 존재함을 암시함.