[논문 리뷰] Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements - a worldwide benchmark study

Björn Hellenkamp, Sonja Schmid외 51명|arXiv (Cornell University)|2017. 10. 10.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques인용 수 13

한 줄 요약

이 세계적 벤치마크 연구는 표준화된 염기서열에 발라진 염색체를 사용하여 20개의 연구소에서 수행된 단일분자 FRET(smFRET) 측정의 정밀도와 정확도를 평가한다. 연구는 FRET 효율을 ±0.02에서 ±0.05의 표준편차로 측정할 수 있음을 보여주며, 보정된 광물리적 매개변수를 사용하여 FRET 효율을 정확한 거리로 변환하는 검증된 프로토콜을 제공함으로써 smFRET 기반의 구조생물학에서의 재현성과 신뢰성을 크게 향상시킨다.

ABSTRACT

Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is increasingly being used to determine distances, structures, and dynamics of biomolecules in vitro and in vivo. However, generalized protocols and FRET standards ensuring both the reproducibility and accuracy of measuring FRET efficiencies are currently lacking. Here we report the results of a worldwide, comparative, blind study, in which 20 labs determined the FRET efficiencies of several dye-labeled DNA duplexes. Using a unified and straightforward method, we show that FRET efficiencies can be obtained with a standard deviation between $Δ$E = +-0.02 and +-0.05. We further suggest an experimental and computational procedure for converting FRET efficiencies into accurate distances. We discuss potential uncertainties in the experiment and the modelling. Our extensive quantitative assessment of intensity-based smFRET measurements and correction procedures serve as an essential step towards validation of distance networks with the ultimate aim to archive reliable structural models of biomolecular systems obtained by smFRET-based hybrid methods.

연구 동기 및 목표

• 다양한 독립된 연구소에서의 smFRET 측정 재현성과 정확도를 평가하기 위해.
• 강도 기반 smFRET 측정에서의 주요 불확실성 원인을 특정하고 정량화하기 위해.
• 보정된 광물리적 매개변수를 사용하여 FRET 효율을 정확한 거리로 변환하는 표준화되고 보편적으로 적용 가능한 프로토콜을 수립하기 위해.
• smFRET의 신뢰성을 향상시키기 위한 검증된 프레임워크를 제공하기 위해.

제안 방법

• 동일한 염색체 라벨링을 가진 DNA 이중사슬을 사용하여 20개의 독립된 연구소가 참가한 세계적이고 익명의 비교 연구를 수행하였다.
• 기부자 및 수용자 광자 수에서 FRET 효율을 계산하는 데 사용된 통일된 간단한 방법을 적용하였다.
• 양자수율(ΦD), 기부자 및 수용자 흡광계수(εD, εA), 스펙트럼 겹침(J), 그리고 정렬 인자(κ²)를 포함한 광물리적 매개변수에 대한 보정 절차를 적용하였다.
• 회전 평균화 상태를 평가하고 κ² = 2/3 조건 하에서의 타당성을 검증하기 위해 시간에 따라 변화하는 이소트로피 측정을 실시하였다.
• 에러 전파를 사용하여 각 매개변수의 불확실성 기여도를 계산하였으며, 포르스터 반경 R0의 총 불확실성은 R0의 ≤7%로 추정되었다.
• β인자 네트워크의 자기일관성 검증과 모델 거리와의 비교를 통해 결과를 검증하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 표준화된 샘플을 사용하여 다양한 연구소에서 smFRET 효율 측정의 재현성은 어떠한가?
• RQ2 광물리적 매개변수(ΦD, εD, εA, J, κ²)의 불확실성은 smFRET에서의 거리 계산 정확도에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ3 실험적 및 모델링 가정(예: 이sovotropic 다이폴 방향, 고정된 염색체 위치)은 FRET 거리 정확도에 얼마나 큰 영향을 미치는가?
• RQ4 표준화된 보정 프로토콜은 smFRET 기반의 거리 측정에서 변동성을 크게 줄이고 정확도를 향상시킬 수 있는가?

주요 결과

• 20개의 연구소에서 FRET 효율이 ±0.02에서 ±0.05의 표준편차로 측정되어 높은 재현성을 보였다.
• 포르스터 반경 R0의 불확실성은 R0의 ≤7%로 추정되었으며, 주요 기여도는 κ²(±5%), J(±2.5%), ΦD(±2%), εA(±2%)에서 비롯되었다.
• 정적 상태에서 이소트로피 값이 0.2 이하일 경우, 이sovotropic 듀얼 방향 가정(κ² = 2/3)이 타당함을 검증하였다.
• 시간에 따라 변화하는 이소트로피 측정을 통해 회전 상관 시간이 충분히 짧아 κ² = 2/3를 정당화할 수 있었으며, 잔류 이소트로피 값은 0.1 이하였다.
• Atto647N와 같은 잘 특성화된 염색체를 사용함으로써 불확실성이 감소하였고, 다양한 실험 설정에서도 프로토콜이 강건함을 입증하였다.
• 본 연구는 정확한 smFRET 거리 측정을 위한 검증된 보편적 적용 가능한 프레임워크를 제공하며, 하이브리드 구조 모델링에 필수적이다.