[논문 리뷰] Rapid and Accurate Detection of SARS-CoV-2 Mutations using a Cas12a-based Sensing Platform

Cai He, Chung‐Chih Lin외 15명|arXiv (Cornell University)|2021. 10. 25.

CRISPR and Genetic Engineering참고 문헌 11인용 수 4

한 줄 요약

이 연구는 RT-PCR 이후 10분 이내에 형광 또는 라티스 흐름 판독 방식을 사용하여 주요 사스-코로나2 스파이크 변이(예: N501Y, D614G, 69/70 삭제)를 빠르고 민감하고 특이적으로 감지할 수 있는 Cas12a 기반 CRISPR 감지 플랫폼인 RT-CORDS를 제시한다. 이 방법은 염기서열 분석과 비교해 100% 정확도를 보이며, 감지 한계는 6 copies/μL(10⁻¹⁷ M)에 달해 임상적 변이 감시에 적용 가능한 확장 가능한 도구를 제공한다.

ABSTRACT

The increasing prevalence of SARS-CoV-2 variants with spike mutations has raised concerns owing to higher transmission rates, disease severity, and escape from neutralizing antibodies. Rapid and accurate detection of SARS-CoV-2 variants provides crucial information concerning the outbreaks of SARS-CoV-2 variants and possible lines of transmission. This information is vital for infection prevention and control. We used a Cas12a-based RT-PCR combined with CRISPR on-site rapid detection system (RT-CORDS) platform to detect the key mutations in SARS-COV-2 variants, such as 69/70 deletion, N501Y, and D614G. We used type-specific CRISPR RNAs (crRNAs) to identify wild-type (crRNA-W) and mutant (crRNA-M) sequences of SARS-CoV-2. We successfully differentiated mutant variants from wild-type SARS-CoV-2 with a sensitivity of $10^{-17}$ M (approximately 6 copies/$μ$L). The assay took just 10 min with the Cas12a/crRNA reaction after a simple RT-PCR using a fluorescence reporting system. In addition, a sensitivity of $10^{-16}$ M could be achieved when lateral flow strips were used as readouts. The accuracy of RT-CORDS for SARS-CoV-2 variant detection was 100% consistent with the sequencing data. In conclusion, using the RT-CORDS platform, we accurately, sensitively, specifically, and rapidly detected SARS-CoV-2 variants. This method may be used in clinical diagnosis.

연구 동기 및 목표

• 신속하고 정확하며 확장 가능한 방법을 개발하여 새로운 변이에서 임상적으로 중요한 사스-코로나2 스파이크 변이를 감지하는 것.
• 실시간으로 원형 및 변이 사스-코로나2 바이러스 주형을 구분할 수 있는 현장 진단 도구에 대한 급박한 필요를 해결하는 것.
• 저비용, 고특이성 감지 플랫폼을 제공하여 유행병 추적 및 감염 관리에 신속한 대응을 가능하게 하는 것.

제안 방법

• RT-CORDS 플랫폼은 사스-코로나2 바이러스의 원형(크나이브-와이드) 및 변이형(크나이브-멀티플렉스) 시퀀스를 타겟으로 하는 특이적 crRNA를 사용하여 역전사(RT)와 CRISPR-Cas12a 기반 감지를 결합한다.
• Cas12a는 crRNA로 프로그래밍되어 목표 서열에 결합할 경우 레포터 프로브를 절단하여 실시간 형광 신호를 생성한다.
• 이 시스템은 정량적 감지를 위해 형광 신호 시스템을 사용하거나 자원이 제한된 환경에서의 시각적 판독을 위해 라티스 흐름 스트립을 활용한다.
• 이 방법은 표준 RT-PCR 증폭 단계 이후에 적용되어 높은 민감도와 특이도를 확보한다.
• 감지는 활성화된 Cas12a의 보조 절단 활성에 의존하며, 이는 신호 증폭과 낮은 감지 한계를 가능하게 한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 CRISPR-Cas12a 기반 플랫폼이 빠른 형식으로 주요 사스-코로나2 스파이크 변이를 고감도 및 고특이도로 감지할 수 있는가?
• RQ2 RT-CORDS 플랫폼은 변이 감지에서 금표준 Sanger 염기서열 분석과 비교해 정확도가 어떻게 되는가?
• RQ3 형광 및 라티스 흐름 판독 방식을 사용할 때 변이 사스-코로나2 서열의 감지 한계는 무엇인가?
• RQ4 이 플랫폼은 최소한의 장비와 훈련으로 현장 진단에 적합하게 변형될 수 있는가?

주요 결과

• 형광 판독 방식을 사용할 경우 RT-CORDS 플랫폼은 10⁻¹⁷ M(약 6 copies/μL)의 감지 한계를 달성하여 높은 민감도를 입증하였다.
• 라티스 흐름 스트립 판독 방식을 사용할 경우 감지 한계는 10⁻¹⁶ M였으며, 이는 시각적 감지 형식에서도 뛰어난 성능을 보임을 시사한다.
• 이 방법은 Sanger 염기서열 분석 결과와 100% 일致하여 원형과 변이형 사스-코로나2 바이러스 주형을 정확하게 구분할 수 있음을 확인하였다.
• RT-PCR 이후 10분 이내에 변이 감지가 완료되어 임상 및 공중보건 목적에 적합한 빠른 결과 도출이 가능했다.
• 특이적 변이 crRNA를 사용하여 N501Y, D614G 및 69/70 삭제와 같은 주요 변이를 성공적으로 구분하였다.