[논문 리뷰] Reaction of the desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii with superoxide anion. Evidence for a superoxide reductase activity

Murielle Lombard, Marc Fontecave외 2명|PubMed|2014. 12. 16.

Environmental Toxicology and Ecotoxicology참고 문헌 26인용 수 133

한 줄 요약

이 연구는 *Desulfoarculus baarsii*의 디설루포페로도크신이 슈퍼옥사이드 디소르바제이스가 아니라 슈퍼옥사이드 레덕타제로 작용하며, 철(II) 중심을 통해 슈퍼옥사이드 이온(O₂⁻)을 효율적으로 환원함을 보여준다. 이 반응의 속도 상수가 6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹이다. 이 효소는 *E. coli* 추출물에서 NADH/NADPH에 의해 재생되며, 황산염 감소 세균에서 새로운 산화 스트레스 방어 메커니즘이 존재함을 시사한다.

ABSTRACT

Desulfoferrodoxin is a small protein found in sulfate-reducing bacteria that contains two independent mononuclear iron centers, one ferric and one ferrous. Expression of desulfoferrodoxin from Desulfoarculus baarsii has been reported to functionally complement a superoxide dismutase deficient Escherichia coli strain. To elucidate by which mechanism desulfoferrodoxin could substitute for superoxide dismutase in E. coli, we have purified the recombinant protein and studied its reactivity toward O-(2). Desulfoferrodoxin exhibited only a weak superoxide dismutase activity (20 units mg(-1)) that could hardly account for its antioxidant properties. UV-visible and electron paramagnetic resonance spectroscopy studies revealed that the ferrous center of desulfoferrodoxin could specifically and efficiently reduce O-(2), with a rate constant of 6-7 x 10(8) M(-1) s(-1). In addition, we showed that membrane and cytoplasmic E. coli protein extracts, using NADH and NADPH as electron donors, could reduce the O-(2) oxidized form of desulfoferrodoxin. Taken together, these results strongly suggest that desulfoferrodoxin behaves as a superoxide reductase enzyme and thus provide new insights into the biological mechanisms designed for protection from oxidative stresses.

연구 동기 및 목표

• 디설루포페로도크신이 *E. coli*에서 슈퍼옥사이드 디소르바제이스 결핍을 어떻게 보완하는지 생화학적 기작을 규명하는 것.
• 디설루포페로도크신이 슈퍼옥사이드 디소르바제이스인지 또는 다른 항산화 효소인지 명확히 하는 것.
• 두 개의 철 중심이 슈퍼옥사이드 이온(O₂⁻)에 대해 어떻게 환원 상태로 반응하는지의 환원적 성질과 반응성을 조사하는 것.
• 생리적 전자 기증체(NADH/NADPH)가 단백질의 산화된 형태를 재생하는 데서의 역할을 평가하는 것.
• 철(II) 중심이 슈퍼옥사이드 환원 반응의 kinetic 매개변수를 확립하는 것.

제안 방법

• 재조합 디설루포페로도크신을 *E. coli*에서 정제하여 동결 및 분석을 위해 순수 상태로 확보하였다.
• 우리형광 및 전자공명흡착분석(EPR) 분석을 통해 슈퍼옥사이드와 반응하는 동안 철 중심의 변화를 모니터링하였다.
• 정지 유동 동역학 측정을 수행하여 철(II) 중심이 슈퍼옥사이드를 환원하는 속도 상수를 결정하였다.
• *E. coli*의 세포질 및 세밀포막 단백질 추출물을 사용하여 NADH와 NADPH를 전자 기증체로 삼아 산화된 디설루포페로도크신의 환원 능력을 시험하였다.
• 크로뮴산-크로뮴산 산화효소 시스템을 사용하여 분광학적으로 슈퍼옥사이드 디소르바제이스(SOD) 활성을 측정하였다.
• 산소 라디칼에 의한 간섭을 방지하기 위해 혐기 조건에서 단백질의 반응성을 평가하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 디설루포페로도크신은 슈퍼옥사이드 디소르바제이스 활성을 보이며, 알려진 SOD들과 비교해 얼마나 효율적인가?
• RQ2 디설루포페로도크신의 철(II) 중심이 직접 슈퍼옥사이드 이온을 환원할 수 있으며, 이 반응의 속도 상수는 얼마인가?
• RQ3 *E. coli*에서 생리적 전자 기증체(NADH, NADPH)가 산화된 디설루포페로도크신의 재생에 기여하는가?
• RQ4 디설루포페로도크신의 두 개의 고유한 철 중심이 슈퍼옥사이드와의 상호작용에서 어떤 역할을 하는가?
• RQ5 실제 생체 내에서 디설루포페로도크신은 슈퍼옥사이드 디소르바제이스가 아니라 슈퍼옥사이드 레덕타제로 주로 작용하는가?

주요 결과

• 디설루포페로도크신은 약한 슈퍼옥사이드 디소르바제이스 활성(20 단위/mg)을 보이며, 이는 SOD 결핍 *E. coli*에서의 功能 보완에 기여하기에는 부족하다.
• 철(II) 중심이 슈퍼옥사이드 이온을 특이적으로 환원하며, 이의 이차 반응 속도 상수가 6–7 × 10⁸ M⁻¹s⁻¹로 나타나 높은 촉매 효율성을 보인다.
• 우리형광 및 EPR 분석을 통해 철(II) 중심이 슈퍼옥사이드 환원의 위치이며, 산화되어 철(III) 상태로 전환됨을 확인하였다.
• NADH 또는 NADPH를 공급할 경우, *E. coli*의 세포질 및 세밀포막 추출물이 산화된(철(III)) 디설루포페로도크신을 효율적으로 재생하였다.
• 생리적 전자 기증체 존재 하에서 철(II)과 철(III) 상태를 오가는 디설루포페로도크신의 능력은 슈퍼옥사이드 레덕타제 기작을 뒷받침한다.
• 모든 데이터는 디설루포페로도크신이 주로 슈퍼옥사이드 레덕타제로 작용하며, 황산염 감소 세균에서 새로운 항산화 경로를 제공함을 종합적으로 시사한다.