[논문 리뷰] Real-time PCR (qPCR) assay for Rhizoctonia solani anastomoses group AG2-2IIIb

Sayed Jaffar Abbas, Bashir Ahmad외 1명|arXiv (Cornell University)|2014. 11. 01.

Plant Disease Resistance and Genetics인용 수 7

한 줄 요약

이 연구는 사탕무와 옥수수의 주요 토양 전파 병원균인 Rhizoctonia solani 아나스토모시스 그룹 AG2-2 IIIb를 특이적으로 검출하고 정량하기 위해 rDNA의 ITS 영역을 표적으로 삼는 고감도 실시간 qPCR 분석법을 제시한다. 이 분석법은 1.8 pg의 게놈 DNA를 정량할 수 있는 한계를 가지며, 증폭 효율성이 96.4%에 이르러 식물 뿌리, 잔해 및 토양에서 정확한 진단과 병원균의 양을 모니터링할 수 있다.

ABSTRACT

Rhizoctonia solani anastomosis group AG2-2 IIIB is a severe sugar beet and maize pathogen. It causes crown and root rot disease which leads to yield losses world-wide. The soil-borne pathogen is difficult to detect and quantify by conventional methods. We developed a real-time PCR (qPCR) assay for the quantification of genomic DNA of Rhizoctonia solani AG2-2 IIIB based on the ITS region of rDNA genes. The limit of quantification of the assay is 1.8 pg genomic DNA. The amplification efficiency was 96.4. The assay will be helpful in the diagnoses of Rhizoctonia solani infection of sugar beet and maize roots and in the quantification of R. solani AG2-2 IIIB inoculum in plant debris and soil.

연구 동기 및 목표

• 농업 샘플 내 Rhizoctonia solani 아나스토모시스 그룹 AG2-2 IIIb를 특이적이고 민감하게 검출하기 위한 분자적 방법을 개발하기.
• 기존의 검출 방법이 느리고 정량적이지 않으며 토양 전파 병원균에 대해 덜 신뢰할 수 있다는 한계를 극복하기.
• 식물 뿌리, 잔해 및 토양 내 병원균의 초기 감염 정도를 정확히 정량하여 질병 예측 및 관리 개선에 기여하기.
• qPCR에서 고특이성 및 신뢰할 수 있는 증폭을 위해 rDNA의 내부 전환 영역(ITS)을 표적으로 삼기.
• 사탕무 및 옥수수 재배에서 Rhizoctonia solani 감염의 조기 진단을 위한 견고한 분자 도구를 구축하기.

제안 방법

• Rhizoctonia solani AG2-2 IIIb의 리보솜 DNA의 ITS 영역을 표적으로 삼는 종 특이적 프리머 설계.
• 정량적 검출을 위한 SYBR Green 기반 실시간 PCR(qPCR) 반응 최적화.
• 시리얼 희석된 게놈 DNA를 사용하여 정량의 한계 및 증폭 효율성 측정.
• 유사한 곰팡이 균주 및 비표적 생물의 DNA를 사용하여 분석법의 특이성 검증.
• 시리얼 희석으로부터 유도된 표준 곡선 분석을 통해 증폭 효율성 계산.
• 실제로 감염된 옥수수 및 사탕무 뿌리 샘플, 그리고 토양 및 식물 잔해에서 R. solani AG2-2 IIIb의 검출 및 정량에 분석법 적용.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 고감도로 Rhizoctonia solani 아나스토모시스 그룹 AG2-2 IIIb를 특이적으로 검출할 수 있는 qPCR 분석법을 개발할 수 있는가?
• RQ2 이 qPCR 분석법을 통해 감지할 수 있는 최소 게놈 DNA 농도는 얼마인가?
• RQ3 이 분석법의 동적 범위 전반에서 증폭 과정은 얼마나 효율적인가?
• RQ4 토양 및 식물 잔해와 같은 복잡한 환경 샘플에서 이 분석법이 R. solani AG2-2 IIIb를 신뢰성 있게 정량할 수 있는가?
• RQ5 근연된 곰팡이 종 또는 비표적 생물에 대해 이 분석법은 특이성을 유지하는가?

주요 결과

• qPCR 분석법은 1.8 pg의 게놈 DNA를 정량할 수 있는 한계를 확보하여 병원균 검출에 있어 고감도임을 입증하였다.
• 증폭 효율성이 96.4%로 측정되어 표준 곡선 전반에서 높은 신뢰성과 선형성을 보였다.
• 감염된 옥수수 및 사탕무 뿌리에서 R. solani AG2-2 IIIb를 고특이성으로 성공적으로 검출하고 정량하였다.
• 이 방법은 식물 잔해 및 토양 샘플 내 병원균의 초기 감염 정도를 정확히 정량할 수 있었으며, epidemiological 연구에의 적용 가능성을 뒷받침하였다.
• 분석법은 AG2-2 IIIb에 대해 특이성을 보였으며, 음성 대조군이나 관련 곰팡이 종에서의 교차 증폭이 관찰되지 않았다.
• 개발된 qPCR 프rotocol는 농업 시스템 내 R. solani 감염의 조기 진단 및 모니터링을 위한 견고하고 재현 가능한 도구를 제공한다.