[논문 리뷰] Reducing Photobleaching in STED Microscopy with Higher Scanning Speed

Yong Wu|arXiv (Cornell University)|2014. 08. 07.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques인용 수 1

한 줄 요약

이 연구는 공진 스캔 STED 현미경에서 스캔 속도를 높임으로써 광분해를 현저히 감소시키고, 특히 고강도 탈염 레이저 조건에서 발광 수율을 향상시킴을 입증한다. 8배 넓은 시야를 가진 조건에서, 탈염 조사 강도가 >0.2 GW·cm⁻²일 경우 Atto 647N 염료의 발광 생존 시간이 약 80% 증가하였으며, 이는 광분해가 주로 자극된 형광체에 작용하는 탈염 레이저에 의해 주도됨을 확인한다.

ABSTRACT

Photobleaching is a major limitation of superresolution Stimulated Depletion Emission (STED) microscopy. Fast scanning has long been considered an effective means to reduce photobleaching in fluorescence microscopy, but a careful quantitative study of this issue is missing. In this paper, we show that the photobleaching rate in STED microscopy is slowed down and fluorescence yield is enhanced by scanning with high linear speed, enabled by the large field of view in our custom-built resonant-scanning STED microscope. The effect of scanning speed on photobleaching and fluorescence yield is more remarkable at higher levels of depletion laser irradiance, and virtually disappears in conventional confocal microscopy. With a depletion irradiance of >0.2 GW$\cdot$cm$^{-2}$ (time average), we were able to extend the fluorescence survival time of the Atto 647N dye by ~80% with an 8-fold wider field of view. We confirm that STED Photobleaching is primarily caused by the depletion light acting upon the excited fluorophores. Experimental data agree with a theoretical model. Our results encourage further increasing linear scanning speed for photobleaching reduction in STED microscopy.

연구 동기 및 목표

• 초해상도 영상에서 주요 제한 요소인 광분해에 영향을 미치는 스캔 속도의 영향을 조사하는 것.
• 더 빠른 스캔이 형광체가 탈염 레이저에 노출되는 시간을 최소화하여 광분해를 감소시키는지 확인하는 것.
• 다양한 탈염 레이저 강도 조건에서 스캔 속도, 시야, 발광 생존 간의 관계를 정량화하는 것.
• 펄스 탈염 조사 조건 하에서 광분해 역학을 기술하는 이론적 모델을 검증하는 것.
• STED에서 광분해가 주로 자극 상태 형광체에 작용하는 탈염 레이저에 의해 유도됨을 입증하는 것.

제안 방법

• 큰 시야를 가진 고속 선형 스캔 속도를 가능하게 하는 맞춤형 공진 스캔 STED 현미경을 사용하였다.
• 시야를 조절하여 스캔 속도를 다양화하였으며, 일관된 레이저 출력과 영상 조건을 유지하였다.
• 다양한 스캔 속도와 탈염 레이저 조사 강도 조건에서 시간에 따른 발광 강도 감쇠를 측정하였다.
• Atto 647N으로 표지된 샘플의 시간 간격 영상 촬영을 통해 광분해 속도와 발광 생존 시간을 정량화하였다.
• 펄스 탈염 자극 조건 하에서 광분해 역학을 기술하는 이론적 모델을 개발하고 적용하였다.
• 공진 조합 검출 유무를 고려하여 다양한 스캔 속도와 탈염 강도 조건에서 결과를 비교하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 스캔 속도를 높이면 STED 현미경에서 광분해가 감소하는가? 만약 감소한다면 얼마나 감소하는가?
• RQ2 탈염 레이저 조사 강도가 증가함에 따라 스캔 속도가 광분해에 미치는 영향은 어떻게 변화하는가?
• RQ3 STED 현미경에서 광분해가 주로 탈염 레이저가 자극 상태 형광체에 작용함으로써 발생하는가?
• RQ4 고속 스캔 조건에서 시야가 광분해 속도에 미치는 영향은 어느 정도인가?
• RQ5 실험 결과가 펄스 탈염 자극 조건 하에서 광분해 역학에 대한 이론적 모델과 얼마나 잘 일치하는가?

주요 결과

• 스캔 속도를 높임으로써 STED 현미경에서 광분해가 현저히 감소하였으며, 특히 고강도 탈염 레이저 조건에서 두드러졌다.
• 8배 넓은 시야 조건에서, 시간 평균 탈염 조사 강도가 >0.2 GW·cm⁻²일 경우 Atto 647N 염료의 발광 생존 시간이 약 80% 증가하였다.
• 광분해 감소 효과는 고강도 탈염 조사 조건에서 가장 두드러졌으며, 전통적인 공진 조합 현미경에서는 미미한 영향을 보였다.
• 실험 데이터는 광분해가 주로 자극 상태 형광체에 작용하는 탈염 레이저에 의해 유도됨을 설명하는 이론적 모델을 강력히 지지하였다.
• 발광 수율 향상과 광분해 감소는 모두 더 빠른 스캔으로 인해 탈염 빔에의 노출 시간이 최소화됨과 직접적으로 관련이 있었다.
• 결과는 선형 스캔 속도를 추가로 증가시키는 것이 STED 현미경에서 광분해를 줄이는 효과적이고 실현 가능한 전략임을 시사한다.