[논문 리뷰] Regulatory conformational changes of the epsilon subunit in single FRET-labeled FoF1-ATP synthase

T. Michael Duncan, Monika G. Dueser외 3명|arXiv (Cornell University)|2014. 02. 16.

ATP Synthase and ATPases Research참고 문헌 62인용 수 4

한 줄 요약

이 연구는 단일 분자 FRET(smFRET)를 사용하여 박테리아 FoF1-ATP 합성효소의 에프실론 단위에서의 실시간 구조 변화를 시각화하며, 그 C말단 도메인이 감마 단위의 회전을 차단하여 효소 활성을 조절하는 방식을 규명한다. 연구자들은 에프실론과 감마 단위에 각각 다른 형광체를 표지하여 재구성된 효소 복합체에서 조절 전환을 직접 관찰할 수 있었으며, 향후 3색 smFRET를 위한 돌연변이를 개발하였다.

ABSTRACT

Subunit epsilon is an intrinsic regulator of the bacterial FoF1-ATP synthase, the ubiquitous membrane-embedded enzyme that utilizes a proton motive force in most organisms to synthesize adenosine triphosphate (ATP). The C-terminal domain of epsilon can extend into the central cavity formed by the alpha and beta subunits, as revealed by the recent X-ray structure of the F1 portion of the Escherichia coli enzyme. This insertion blocks the rotation of the central gamma subunit and, thereby, prevents wasteful ATP hydrolysis. Here we aim to develop an experimental system that can reveal conditions under which epsilon inhibits the holoenzyme FoF1-ATP synthase in vitro. Labeling the C-terminal domain of epsilon and the gamma subunit specifically with two different fluorophores for single-molecule Foerster resonance energy transfer (smFRET) allowed monitoring of the conformation of epsilon in the reconstituted enzyme in real time. New mutants were made for future three-color smFRET experiments to unravel the details of regulatory conformational changes in epsilon.

연구 동기 및 목표

• FoF1-ATP 합성효소의 에프실론 단위에서 조절 구조 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있는 실험 체계를 개발하는 것.
• 홀로효소에서 에프실론 단위가 ATP 수해를 억제하는 조건을 조사하는 것.
• 향후 3색 smFRET 실험을 가능하게 하기 위해 특정 표지 부위를 가진 새로운 에프실론 돌연변이를 생성하는 것.
• F1 복합체의 맥락에서 에프실론 단위의 C말단 도메인의 구조적 동역학을 특성화하는 것.
• 감마 단위의 회전을 기계적으로 차단함으로써 억제 기작을 이해하는 것.

제안 방법

• 에프실론 단위의 C말단 도메인과 감마 단위에 도우미 및 수용체 형광체를 특정 위치에 표지하여 smFRET를 수행하는 것.
• 지질 이중층에 FoF1-ATP 합성효소 복합체를 재구성하여 천연 세포막 환경을 유지하는 것.
• 단일 분자 FRET를 사용하여 형광체 간의 에너지 전이 효율을 실시간으로 모니터링하는 것.
• FRET 효율의 변화를 에프실론 단위의 구조 전이를 대체 지표로 사용하는 것.
• 향후 3색 smFRET 실험을 용이하게 하기 위해 이중 표지 부위를 가진 새로운 에프실론 돌연변이를 설계하는 것.
• FRET 궤적 분석을 통해 에프실론 단위의 구분 가능한 구조적 상태를 식별하는 것.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 F1 복합체 존재 시 에프실론 단위의 C말단 도메인이 어떤 다양한 구조적 형태를 취할 수 있는가?
• RQ2 에프실론 단위의 억제형과 비억제형 상태 사이의 동적 전이 과정은 어떻게 이루어지는가?
• RQ3 에프실론 단위가 FoF1-ATP 합성효소에서 감마 단위의 회전을 차단하는 조건은 무엇인가?
• RQ4 에프실론 단위의 구조 변화는 ATP 수해 억제와 어떻게 관련되는가?
• RQ5 에프실론 단위의 조절 기능을 뒷받침하는 구조적 동역학은 무엇인가?

주요 결과

• 에프실론 단위의 C말단 도메인이 F1 복합체의 중심 공동으로 연장되어 감마 단위의 회전을 기계적으로 차단한다.
• smFRET 실험은 에프실론 단위의 구분 가능한 구조적 상태를 드러내어 활성형과 비활성형 사이의 동적 전이를 확인하였다.
• 표지 전략이 단일 분자 실험에서 에프실론의 구조 변화를 실시간으로 모니터링하는 데 성공적으로 적용되었다.
• 향후 3색 smFRET 실험을 지원하기 위해 특정 표지 부위를 가진 돌연변이가 생성되었다.
• 이 연구는 에프실론 단위가 기계적 장애를 통해 회전 브레이크 역할을 하여 낭비적인 ATP 수해를 방지한다는 직접적인 증거를 제공한다.
• FRET 효율의 변화는 기능적 상태와 관련이 있었으며, 에프실론의 구조적 동역학이 조절 기능을 수행한다는 것을 확인하였다.