[논문 리뷰] Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy (SFCS) with a Scan Path Perpendicular to the Membrane Plane

Paul Müller, Petra Schwille외 1명|arXiv (Cornell University)|2018. 05. 31.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 14인용 수 10

한 줄 요약

이 논문은 거대 이중층 지질방울(GUVs)에서 막 평면에 수직인 스캔 경로로 스캐닝 형광 관련 분석(SFCS)을 수행하기 위한 플랫폼 독립적이고 오픈소스 소프트웨어 파이프라인(PyScanFCS 및 PyCorrFit)을 소개한다. kHz 주파수 스캔에서 측정 후 정렬 및 광자 트레이스 상관 분석을 가능하게 함으로써, 기존 FCS 기법이 막 연구에서 겪는 운동 유도 잡음 및 광분해 문제를 극복하고, 더 높은 안정성과 신호 대 잡음 비율을 확보하여 지질 이중층 내에서의 확산 계수 및 분자 상호작용을 정확하게 측정할 수 있다.

ABSTRACT

Scanning fluorescence correlation spectroscopy (SFCS) with a scan path perpendicular to the membrane plane was introduced to measure diffusion and interactions of fluorescent components in free standing biomembranes. Using a confocal laser scanning microscope (CLSM) the open detection volume is moved laterally with kHz frequency through the membrane and the photon events are continuously recorded and stored in a file. While the accessory hardware requirements for a conventional CLSM are minimal, data evaluation can pose a bottleneck. The photon events must be assigned to each scan, in which the maximum signal intensities have to be detected, binned, and aligned between the scans, in order to derive the membrane related intensity fluctuations of one spot. Finally, this time-dependent signal must be correlated and evaluated by well known FCS model functions. Here we provide two platform independent, open source software tools (PyScanFCS and PyCorrFit) that allow to perform all of these steps and to establish perpendicular SFCS in its one- or two-focus as well as its single- or dual-colour modality.

연구 동기 및 목표

• 동적 생물막을 연구할 때 기존 단일점 FCS에서 발생하는 운동 유도 잡음 및 광분해 문제를 해결하기 위해.
• 수직 스캔을 활용하여 거대 이중층 지질방울(GUVs)에서 막 확산 및 단백질 상호작용을 고정밀도로 측정하기 위해.
• 수평 스캔 경로를 위한 강력하고 오픈소스이며 플랫폼 독립적인 SFCS 데이터 분석 파이프라인을 제공하기 위해.
• 다양한 막 생물물리학 적용을 위한 단일 및 双색, 단일 및 이중 집중점 SFCS 모드를 모두 지원하기 위해.

제안 방법

• Confocal laser scanning microscope(CLSM)를 사용하여 막 평면에 수직인 kHz 주파수의 수평 스캔을 수행하고, 광자 이벤트는 시간에 따라 연계된 단일 광자 계측(TCSPC) 방식으로 기록한다.
• PyScanFCS를 활용하여 광자 도착 시간의 빠른 푸리에 변환(FFT)을 통해 스캔 주기 시간을 탐지하고, 다중 스캔에서 유도된 강도 트레이스를 카이모그래프로 정렬하여 시각화한다.
• 비닝 및 광분해 보정을 적용하여 스캔 경로를 따라 막 특이적 강도 변동을 추출한다.
• 다중-τ 알고리즘을 사용하여 정렬된 트레이스에서 시간에 따른 강도 변동을 계산한다.
• PyCorrFit를 활용하여 상관 곡선을 표준 FCS 모델 함수에 적합시켜 확산 시간, 확산 계수 및 입자 수를 추출한다.
• 사용자 정의 모델 함수 및 공유 매개변수를 가진 다중 데이터셋 분석을 위한 글로벌 피팅을 지원한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 측정 후 스캔 정렬을 통한 수직 SFCS가 GUVs에서 막 이동 및 이동 유도 잡음을 효과적으로 줄일 수 있는가?
• RQ2 수직 SFCS의 신호 대 잡음 비율과 측정 지속 시간이 막 시스템에서 기존 단일점 FCS와 비교해 어떻게 다른가?
• RQ3 PyScanFCS 및 PyCorrFit와 같은 오픈소스 소프트웨어 도구가 다양한 연구소 간에서 재현 가능하고 접근 가능한 SFCS 분석을 얼마나 잘 가능하게 하는가?
• RQ4 캘리브레이션 기준으로 앨라카 488을 용액상에서 사용할 때 수직 SFCS를 통한 확산 계수 측정 정확도는 어느 정도인가?
• RQ5 이 수직 스캔 방식을 활용해 이중색 SFCS를 신뢰성 있게 적용하여 막 내 단백질-단백질 상호작용을 연구할 수 있는가?

주요 결과

• -vesicle 이동이나 형태 변화가 있더라도 스캔 트레이스를 측정 후 정렬함으로써 운동 유도 잡음을 효과적으로 완화하여 신뢰할 수 있는 상관 분석이 가능하다.
• 수직 SFCS는 레이저 집중부가 스캔 주기의 대부분 동안 막 외부에 머무르므로 광분해를 줄여 시간에 따른 신호 안정성을 향상시킨다.
• 22°C에서 10 mM 트리스 버퍼 내 앨라카 488의 확산 계수는 (4.35 ± 0.1) × 10⁻¹⁰ m²/s로 측정되어 신뢰할 수 있는 캘리브레이션 기준이 된다.
• 광자 도착 시간의 FFT를 통해 산정된 스캔 주기 시간은 LSM 소프트웨어에 의해 설정된 명시적 값과 다를 수 있으므로 실증적 검증이 필요하다.
• PyCorrFit는 표준 FCS 모델에 대한 강력한 피팅을 가능하게 하며, 공유 매개변수를 가진 다중 데이터셋 분석도 지원한다.
• 소프트웨어 파이프라인은 사용자 정의 모델 함수를 지원하여 복잡한 막 동역학 분석에 대한 유연성을 높인다.