[논문 리뷰] Sequencing single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 platform

Johanna L. A. Paijmans, Sina Baleka외 5명|arXiv (Cornell University)|2017. 11. 29.

Genomics and Phylogenetic Studies참고 문헌 1인용 수 34

한 줄 요약

이 논문은 Illumina NextSeq 500 플랫폼에서 단일화합체 DNA 라이브러리의 시퀀싱 순서를 최적화하여 2.2 pM의 로딩 농도와 최대 250 k/mm²의 클러스터 밀도를 제안함으로써 높은 데이터 품질(80% 이상의 필터 통과율)을 유지하면서 수확량을 증가시킴. 또한 고유의 인덱스 리드 2 프리머(Gesaffelstein)를 도입하고 Qubit과 Tapestation를 사용한 정밀한 라이브러리 농도 측정을 강조하여 일관된 결과를 확보함.

ABSTRACT

Single-stranded libraries generated from ancient DNA extracts have specific sequencing requirements. The short library molecules typically associated with ancient DNA templates are expected to behave differently during the annealing to the flow cell and subsequent cluster generation (bridge PCR), requiring optimisation of loading amounts to obtain optimal and consistent cluster densities. For the past 3 years, we have carried out sequencing of single-stranded libraries on the Illumina NextSeq 500 sequencing platform at the Institute for Biochemistry and Biology, University of Potsdam. We report our optimisations here. This document may be useful for other researchers wishing to sequence single-stranded libraries on the NextSeq 500 platform. It does not replace the excellent documentation provided by Illumina (links provided below), but rather serves as additional information specific to single-stranded libraries. The original papers describing the library protocol should also be studied in detail, and complement the information presented here.

연구 동기 및 목표

• Illumina NextSeq 500 플랫폼에서 단일화합체 DNA 라이브러리 시퀀싱 시 낮은 클러스터 수확량과 일관되지 않은 데이터 품질 문제를 해결하기 위해.
• 단일화합체 라이브러리에 대해 Illumina의 기본 권장 사항을 초월해 로딩 농도와 클러스터 밀도를 최적화하기 위해.
• 이중인덱스 단일화합체 라이브러리에 적합한 고유의 인덱스 리드 2 시퀀싱 프리머(Gesaffelstein)를 개발하고 검증하기 위해.
• qPCR를 사용하지 않고도 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법으로 단일화합체 라이브러리를 정량화하기 위한 방법 수립을 위해.
• Ancient 또는 손상된 DNA 샘플을 NextSeq 500에서 시퀀싱하는 연구자들에게 실용적이고 검증된 워크플로우 제공을 위해.

제안 방법

• 이중인덱스 단일화합체 라이브러리에 대해 고유의 5’-3’ 서열(Gesaffelstein: GGA AGA GCG TCG TGT AGG GAA AGA GTG T)을 인덱스 리드 2 시퀀싱 프리머로 사용함.
• Illumina가 권장하는 1.8 pM보다 높은 2.2 pM의 로딩 농도를 적용하여 짧은 단일화합체 DNA 템플릿에서의 클러스터 형성 향상.
• Illumina가 권장하는 129–165 k/mm²를 초월해 최대 250 k/mm²까지 클러스터 밀도를 최적화하였으며, 데이터 품질 저하가 최소한이었음.
• Qubit HS DNA Assay(≥10 µL)와 Agilent Tapestation의 D1000 High-Sensitivity ScreenTape를 사용해 라이브러리 농도를 측정하고 모달 프래그먼트 길이를 추정함.
• 모달 프래그먼트 길이와 Qubit 농도를 기반으로 몰농도를 계산하여 라이브러리 풀링 시 qPCR를 회피함.
• 정량 정확도를 위한 제어로 Qubit BR Assay Standard #2(약 50 ng/µL)의 1:2 희석액을 사용함.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 Illumina NextSeq 500에서 단일화합체 라이브러리의 클러스터 수확량과 데이터 품질을 극대화하기 위해 최적의 로딩 농도는 무엇인가?
• RQ2 단일화합체 라이브러리에서 데이터 품질 저하가 발생하기 전까지 클러스터 밀도는 어느 정도까지 증가시킬 수 있는가?
• RQ3 Illumina NextSeq 500에서 단일화합체 라이브러리의 효율적인 이중인덱스 시퀀싱을 위해 필요한 고유의 시퀀싱 프리머는 무엇인가?
• RQ4 QPCR를 사용하지 않고 Qubit과 Tapestation를 통해 신뢰할 수 있는 라이브러리 정량이 가능할 수 있는가?
• RQ5 라이브러리 농도와 프래그먼트 크기 분포는 단일화합체 라이브러리 시퀀싱에서 클러스터 밀도 일관성에 어떤 영향을 미치는가?

주요 결과

• 단일화합체 라이브러리를 2.2 pM에서 로딩할 경우, 특히 고대 DNA의 짧은 프래그먼트에서 표준 1.8 pM보다 클러스터 형성이著しく 향상됨.
• 최대 250 k/mm²까지의 클러스터 밀도에서도 80% 이상의 클러스터가 충실도 및 q30 필터를 통과함을 확인하여 높은 데이터 품질 유지를 확인함.
• 클러스터 밀도가 약 250 k/mm²까지 증가함에 따라 수확량이 거의 선형적으로 증가하였으며, 200–250 k/mm²를 초과하면 약간의 감소가 관찰됨.
• 고유의 인덱스 리드 2 프리머(Gesaffelstein)는 이중인덱스 단일화합체 라이브러리의 효율적인 시퀀싱을 가능하게 하였으며, 이는 일반 프리머로는 실패하는 경우가 있음.
• 모달 프래그먼트 길이와 Qubit 농도를 기반으로 몰농도를 추정하는 방식으로 Qubit과 Tapestation를 사용할 경우, qPCR이 필요 없이 일관되고 예측 가능한 클러스터 밀도를 확보함.
• 초기 농도가 2.5 nM 이하인 라이브러리는 일관되지 않은 시퀀싱 결과를 보이며, 신뢰할 수 있는 풀링을 위한 실질적인 하한선을 나타냄.