[논문 리뷰] Simultaneous multiplane imaging with reverberation multiphoton microscopy

Devin R. Beaulieu, Ian G. Davison외 2명|arXiv (Cornell University)|2018. 12. 12.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 24인용 수 3

한 줄 요약

이 논문은 전통적인 다광자 현미경 장비를 사용하여 비디오 속도로 동시에 다중 평면 3차원 부피 영상 촬영이 가능한 반사 다광자 현미경(RMPM) 기술을 소개한다. 특수 캐비티에서 발생하는 광학 반사 현상을 이용해 거의 즉각적인 축 방향 스캐닝을 구현함으로써, RMPM는 해상도가 마이크론 수준임에도 불구하고 영상 속도나 성능을 저하시키지 않으며, 특히 반사율이 높은 조직에서 저반복 주기 레이저를 사용할 때 효과적이다.

ABSTRACT

Multiphoton microscopy (MPM) has gained enormous popularity over the years for its capacity to provide high resolution images from deep within scattering samples1. However, MPM is generally based on single-point laser-focus scanning, which is intrinsically slow. While imaging speeds as fast as video rate have become routine for 2D planar imaging, such speeds have so far been unattainable for 3D volumetric imaging without severely compromising microscope performance. We demonstrate here 3D volumetric (multiplane) imaging at the same speed as 2D planar (single plane) imaging, with minimal compromise in performance. Specifically, multiple planes are acquired by near-instantaneous axial scanning while maintaining 3D micron-scale resolution. Our technique, called reverberation MPM, is well adapted for large-scale imaging in scattering media with low repetition-rate lasers, and can be implemented with conventional MPM as a simple add-on.

연구 동기 및 목표

• 기존 다광자 현미경의 3차원 부피 영상 촬영에서의 근본적인 속도 제한을 극복하기 위해.
• 공간 해상도를 희생시키지 않고도 다중 광학 평면을 동시에 촬영할 수 있도록 하기 위해.
• 표준 다광자 현미경 시스템과 호환되는 실용적인 추가 장치를 개발하여 대규모의 깊은 조직 영상 촬영을 가능하게 하기 위해.
• 기존 방법이 너무 느려서 적용이 어려운 반사율이 높은 생물학적 샘플에서도 높은 영상 성능을 유지하기 위해.

제안 방법

• 이 방법은 흥(excitation) 레이저 빔이 여러 번 왕복하는 것을 유지하는 특수 광학 캐비티를 사용한다.
• 이러한 펄스들은 샘플 내에서 서로 다른 축 방향 깊이에서 공간적으로 집중되어 있으며, 여러 평면에서 동시에 흥(excitation)를 가능하게 한다.
• 축 방향 스캐닝은 레이저 펄스가 캐비티를 왕복하는 데 걸리는 시간을 통해 이루어지며, 기계적 축 스캐닝을 광학적 지연으로 대체한다.
• 낮은 반복 주기 레이저 소스를 사용함으로써, 하드웨어 업그레이드 없이도 표준 다광자 현미경과 호환 가능하다.
• 이미지 복원은 캐비티 내 펄스의 시간적 순서와 검출를 동기화함으로써 서로 다른 축 평면에서 온 신호를 구분할 수 있도록 한다.
• 다중 평면에서 흥(excitation) 빔의 좁은 집중 상태를 유지함으로써 높은 공간 해상도를 유지한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 다광자 현미경에서 공간 해상도를 훼손하지 않고도 비디오 속도로 다중 평면 3차원 영상 촬영이 가능한가?
• RQ2 반사율이 높은 샘플에서 빠른 축 방향 스캐닝을 가능하게 하기 위해 광학 반사를 어떻게 활용할 수 있는가?
• RQ3 이 접근 방식은 고반복 주기 레이저가 필요 없이 기존 다광자 현미경에 간단한 추가 장치로 구현 가능한가?
• RQ4 반사 기반 축 스캐닝을 사용할 경우 도달 가능한 축 해상도와 영상 속도는 어느 정도인가?
• RQ5 기존 스캐닝 방법과 비교해 볼 때, 이 기술은 깊고 반사율이 높은 생물학적 조직에서 어떻게 성능을 발휘하는가?

주요 결과

• 영상 촬속도가 표준 2차원 평면 영상 촬영과 동일한 비디오 속도로 동시에 다중 평면 영상 촬영이 가능하다.
• 심부에 위치한 반사율이 높은 조직에서도 다중 평면에서 마이크론 수준의 3차원 공간 해상도를 유지한다.
• 낮은 반복 주기 레이저로도 효과적으로 작동하여 광손상을 감소시키며 표준 다광자 현미경과 호환 가능하다.
• 광학 반사를 활용함으로써 거의 즉각적인 축 방향 스캐닝이 가능해지며 기계적 스캐닝 스테이지가 필요 없어진다.
• 특히 반사율이 높은 매질에서 대규모 부피 영상 촬영 응용 분야에서 뛰어난 성능을 발휘한다.
• 기존의 다광자 현미경 시스템에 간단한 추가 장치로 구현되어 최소한의 수정만으로도 가능하다.