[논문 리뷰] Single-molecule imaging of DNA gyrase activity in living Escherichia coli

Mathew Stracy, Adam J. M. Wollman외 10명|PubMed|2018. 11. 01.

Advanced biosensing and bioanalysis techniques참고 문헌 15인용 수 5

한 줄 요약

이 연구는 살아있는 *E. coli*에서 고속 단일 분자 형광 영상 기법을 사용하여 실시간으로 DNA 점원효소의 동역학을 시각화한다. 이로써 약 300개의 점원효소 분자가 염색체 DNA에 안정적으로 결합하고 있으며, 이 중 약 12개가 복제우선에서 근접하게 농축되어 있음을 밝혀냈다. 연구는 산산이 흩어진 점원효소 분자들이 약 2초 동안 머무르며 음성 초코일링을 유지하는 반면, 복제우에 가까운 효소들은 약 8초 동안 머무르며 양성 초코일링을 지속적으로 완화함을 보여주었다.

ABSTRACT

Bacterial DNA gyrase introduces negative supercoils into chromosomal DNA and relaxes positive supercoils introduced by replication and transiently by transcription. Removal of these positive supercoils is essential for replication fork progression and for the overall unlinking of the two duplex DNA strands, as well as for ongoing transcription. To address how gyrase copes with these topological challenges, we used high-speed single-molecule fluorescence imaging in live Escherichia coli cells. We demonstrate that at least 300 gyrase molecules are stably bound to the chromosome at any time, with ∼12 enzymes enriched near each replication fork. Trapping of reaction intermediates with ciprofloxacin revealed complexes undergoing catalysis. Dwell times of ∼2 s were observed for the dispersed gyrase molecules, which we propose maintain steady-state levels of negative supercoiling of the chromosome. In contrast, the dwell time of replisome-proximal molecules was ∼8 s, consistent with these catalyzing processive positive supercoil relaxation in front of the progressing replisome.

연구 동기 및 목표

• 살아있는 세포에서 DNA 점원효소가 DNA 복제 및 전사 과정 중 발생하는 토폴로지적 과제를 어떻게 관리하는지 이해하기 위해.
• intact *E. coli* 세포 내에서 점원효소 활동의 공간적·시간적 동역학을 실시간으로 시각화하기 위해.
• 복제우에 대한 세포내 위치에 따라 점원효소 분자의 기능적 특수화를 규명하기 위해.
• 점원효소의 머무름 시간을 정량화하고, 이들이 염색체의 초코일링 균형을 유지하는 데 수행하는 역할을 평가하기 위해.

제안 방법

• 녹색형광단백질(GyrB-GFP)로 표지된 점원효소를 발현하는 살아있는 *E. coli* 세포에서 고속 단일 분자 형광 영상 분석을 수행하였다.
• 점원효소의 촉매 중간체를 고정하기 위해 시프로플록사신을 사용하였다.
• 시간에 따른 영상 촬영을 통해 개별 점원효소 분자의 동역학을 기록하고 머무름 시간을 측정하였다.
• 복제우와 염색체 구조의 마커를 사용하여 세포내 위치를 복제우에 대해 분석하였다.
• 다른 게놈적 맥락에서, 즉 산산이 흩어진 위치와 복제우 근접 위치에서 점원효소의 머무름 시간을 정량화하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 살아있는 *E. coli*에서 어떤 순간에도 염색체에 안정적으로 결합된 점원효소 분자는 약 몇 개인가?
• RQ2 다른 세포내 위치에서 점원효소 분자의 머무름 시간은 어떻게 되는가, 특히 복제우 부근에서 어떻게 되는가?
• RQ3 산산이 흩어진 염색체 결합과 복제우 근접 위치에서의 점원효소 활동은 어떻게 다를까?
• RQ4 점원효소는 실제로 복제우의 앞서는 양성 초코일링을 지속적으로 완화하는가?
• RQ5 점원효소는 음성 초코일링의 정적 수준을 유지하는 데 어떤 기능을 하는가?

주요 결과

• 약 300개의 점원효소 분자가 언제나 *E. coli* 염색체에 안정적으로 결합되어 있음을 확인하여 높은 염색체 점유도를 나타낸다.
• 염색체 전반에 산재한 점원효소 분자들은 약 2초 동안 머무르며, 이는 음성 초코일링의 정적 수준을 유지하는 데 적합하다.
• 복제우에 가까운 점원효소 분자들은 약 8초 동안 머무르며, 이는 양성 초코일링을 지속적으로 완화한다는 것을 시사한다.
• 복제우 부근에서의 증가된 머무름 시간은 DNA 복제 과정에서 발생하는 토폴로지적 스트레스를 해소해야 하는 필요성과 관련이 있다.
• 시프로플록사신에 의한 고정 실험을 통해 관찰된 복합체들이 실제로 점원효소의 활성 촉매 중간체임을 확인하였다.