[논문 리뷰] Spatial and temporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells in a 3D environment revealed by a machine learning-assisted FRET technique

Brian C. H. Cheung, Louis Hodgson외 2명|arXiv (Cornell University)|2021. 09. 29.

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한 줄 요약

이 연구는 단일 MDA-MB-231 유방암 세포가 2차원 및 3차원 환경에서 이동할 때 RhoA 활성도의 시공간적 동역학을 맵핑하기 위해 기계학습 기반 FRET 기술을 도입한다. U-Net 신경망을 활용한 정밀한 세포 분할을 통해 저자들은 2D 환경에서는 RhoA 활성이 앞뒤로 극성화되어 있으며, 명확한 진동 동역학을 보이며, 3D 환경에서는 극성화되지 않고 속도와는 덜 관련되어 있지만, 양 환경에서 세포 길이 증가와 강하게 연관되어 있음을 밝혀냈다.

ABSTRACT

One of the hallmarks of cancer cells is their exceptional ability to migrate within the extracellular matrix (ECM) for gaining access to the circulatory system, a critical step of cancer metastasis. RhoA, a small GTPase, is known to be a key molecular switch that toggles between actomyosin contractility and lamellipodial protrusion during cell migration. Current understanding of RhoA activity in cell migration has been largely derived from studies of cells plated on a two-dimensional (2D) substrate using a FRET biosensor. There has been increasing evidence that cells behave differently in a more physiologically relevant three-dimensional (3D) environment, however, studies of RhoA activities in 3D have been hindered by low signal-to-noise ratio in fluorescence imaging. In this paper, we present a machine learning-assisted FRET technique to follow the spatiotemporal dynamics of RhoA activities of single breast tumor cells (MDA-MB-231) migrating in a 3D as well as a 2D environment using a RhoA biosensor. We found that RhoA activity is more polarized along the long axis of the cell for single cells migrating on 2D fibronectin-coated glass versus those embedded in 3D collagen matrices. In particular, RhoA activities of cells in 2D exhibit a distinct front-to-back and back-to-front movement during migration in contrast to those in 3D. Finally, regardless of dimensionality, RhoA polarization is found to be correlated with cell shape.

연구 동기 및 목표

• 3D FRET 영상에서 RhoA 활성도의 낮은 신호 대 잡음 비율 문제를 해결하기 위해.
• 실시간 세포에서 FRET 및 CFP 영상 쌍을 자동으로 분할하는 강력하고 신뢰할 수 있는 방법을 개발하기 위해.
• 2차원과 3차원 세포외 기질에서 이동하는 단일 MDA-MB-231 세포의 RhoA 활성도의 시공간적 동역학을 비교하기 위해.
• 두 환경에서 RhoA 극성화, 세포 형태, 이동 속도 간의 관계를 조사하기 위해.

제안 방법

• 실시간 세포에서 활성 RhoA(GTP 결합형)를 비율 기반으로 감지하기 위해 유전자로 조작된 단일 사슬 FRET 생체감지기(RhoA FLARE.sc)를 사용하였다.
• FRET 및 CFP 형광 영상에서 세포 윤곽을 정밀하고 자동으로 분할하기 위해 U-Net 컨volution 신경망을 적용하였다.
• 아핀 변환과 베드 기반 영상 정렬을 통해 FRET 및 CFP 채널을 0.045 µm 이내의 초해상 정밀도로 정렬하였다.
• 세포 중심에서의 강도 가중 이동 벡터의 벡터 합을 사용해 RhoA 극성화를 계산하였다.
• Rao의 간격 검정을 적용하여 RhoA 극성화의 방향성 편향을 세포 이동 속도에 대해 평가하였다.
• 스피어만 상관계수를 사용해 극성화 강도, 세포 길이비, 이동 속도 간의 관계를 정량화하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 2D 및 3D 이동 환경 간 RhoA 활성도의 공간적·시간적 차이는 어떻게 다른가?
• RQ2 2D 대비 3D에서 RhoA 극성화가 세포의 긴 축에 얼마나 잘 일치하는가?
• RQ3 2D 및 3D에서 RhoA 극성화는 세포 속도와 상관관계가 있는가?
• RQ4 3D 및 2D에서 RhoA 극성화는 세포 형태(길이비)와 어떻게 관련되어 있는가?
• RQ5 RhoA 활성도는 2D 및 3D에서 주기적인 진동을 보이는가?

주요 결과

• 2D 환경에서는 RhoA 활성이 앞에서 뒤로, 뒤에서 앞쪽으로 진동하는 동역학을 보이며, 3D 환경에서는 극성화되지 않고 공간적으로 비균일한 분포를 보인다.
• 2D에서 RhoA 극성화는 세포의 긴 축에 더 강하게 일치한다(평균余弦 = 0.82), 3D에서는 덜 일치한다(평균余弦 = 0.65), p < 0.001.
• 2D 및 3D 양 환경에서 RhoA 극성화 강도는 세포 길이비와 양의 스피어만 상관관계가 있다(2D에서 ρ = 0.58, 3D에서 ρ = 0.42, p < 0.0001).
• 세포는 2D에서 더 빠르게 이동한다(평균 속도 = 1.8 µm/min), 3D에서는 더 느리다(평균 속도 = 0.9 µm/min), 양 환경에서 속도와 극성화 간 유의미한 상관관계는 없다.
• 2D에서 RhoA 극성화는 일부 세포에서 약 30분의 주기적 진동을 보이며, 3D에서는 유사한 주기성이 관찰되지 않는다.
• Rao의 간격 검정은 2D에서 RhoA 극성화가 세포 이동 속도와 강하게 반대 방향으로 배열되어 있음을 확인한다(180°에서 피크, p < 0.0001), 반면 3D에서는 특정한 각도적 관계가 없음을 보여주며(p = 0.5000).