[논문 리뷰] Spectro-temporal encoded Multiphoton Microscopy

Sebastian Karpf, Carson T. Riche외 6명|arXiv (Cornell University)|2017. 09. 02.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 46인용 수 12

한 줄 요약

이 논문은 퉁성-시간 인코딩을 사용한 다광자 현미경을 제시하며, 펄스 변조된 파장 스위치 레이저와 각도 분산를 활용해 관성 없는 빔 스타일링을 실현함으로써 킬로헤르츠 프레임 레이트를 달성하여 8800만 픽셀/초의 형광 수명 영상(FLIM)을 구현한다. 이 시스템은 고속·고-throughput 영상 촬영을 가능하게 하여 이미지 보조 세포 분류와 같은 응용 분야에 적합한 회절 한계 해상도를 갖춘 다기능 이중광자 형광 및 FLIM을 제공한다.

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

연구 동기 및 목표

• 기계적 스캐너에 의해 제한되는 전통적 이중광자 현미경의 속도 한계를 극복하기 위해.
• 이미지 보조 세포 분류와 같은 고급 생물학적 응용 분야를 위한 고속·고-throughput 영상 촬영을 가능하게 하기 위해.
• 사전에 기록된 속도를 뛰어넘는 초고속으로 회절 한계 해상도를 갖춘 다기능 이중광자 형광 및 형광 수명 영상(FLIM)을 실현하기 위해.
• 디지털로 재구성 가능한 레이저, 영상 시스템 및 데이터 수집 파이프라인을 통합하여 다양한 고대역폭 작업에의 영구적 유연성 제공을 위해.

제안 방법

• 초고속 스펙트럼 인코딩을 위한 펄스 변조된 빠른 파장 스위치 레이저를 사용하여 초단시간 스펙트럼 인코딩된 자극 펄스를 생성한다.
• 관성 없는 빔 스타일링을 위해 각도 분산를 활용하여 기계적 스캔 지연을 제거한다.
• 고대역폭, 단광자 감도가 뛰어난 검출기를 통합하여 고시간 해상도로 형광 신호를 캡처한다.
• 스펙트로-시간 인코딩을 적용하여 시간과 파장에 걸쳐 공간 및 스펙트럼 정보를 다중화한다.
• 디지털로 재구성 가능한 시스템 아키텍처를 도입하여 레이저 파arameter, 영상 모드 및 데이터 수집 설정의 동적 조정이 가능하게 한다.
• 파장 스위치 자극과 시간 해상도 감지를 조합하여 고프레임 레이트에서 형광 수명 측정이 가능하게 한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 스펙트로-시간 인코딩과 파장 스위치 레이저가 기계적 스캔의 한계를 초월해 다광자 현미경에서 킬로헤르츠 프레임 레이트를 달성할 수 있는가?
• RQ2 이 방법을 사용할 경우 형광 수명 영상에서 도달 가능한 최대 픽셀 수집 속도는 얼마인가?
• RQ3 이 시스템은 다기능 이중광자 형광 및 FLIM 영상 촬영을 수행하면서도 회절 한계 해상도를 유지할 수 있는가?
• RQ4 관성 없는 빔 스타일링 메커니즘은 기존 갈바노미터 스캐너에 비해 영상 속도와 안정성에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ5 이 시스템은 다양한 영상 작업과 고-throughput 응용 분야에 대해 얼마나 높은 수준의 디지털 재구성 가능성이 있는가?

주요 결과

• 시스템은 기록적인 형광 수명 영상 속도 8800만 픽셀/초를 달성하여 기존의 한계를 크게 초월한다.
• 각도 분산를 통한 관성 없는 빔 스타일링을 통해 킬로헤르츠 프레임 레이트를 실현하여 기계적 스캔 지연을 제거하였다.
• 고감도와 분자 특이성을 갖춘 회절 한계 해상도의 다기능 이중광자 형광 및 형광 수명 영상(FLIM)을 실현하였다.
• 고속 스캐닝과 고대역폭 감지를 조합함으로써 고-throughput 영상 유세포 분석을 가능하게 하였다.
• 디지털로 재구성 가능한 레이저, 영상 및 데이터 수집 시스템을 통해 다양한 생물학적 영상 작업에의 영구적 적응이 가능하였다.
• 이 방법은 이미지 보조 세포 분류 응용 분야에 적합한 고속·고감도·고해상도 영상 촬영을 가능하게 하였다.