[논문 리뷰] Structured illumination fluorescence microscopy using Talbot self-imaging effect for high-throughput visualization

Shwetadwip Chowdhury, Jeffrey Chen외 1명|arXiv (Cornell University)|2018. 01. 10.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 12인용 수 6

한 줄 요약

이 논문은 전통적인 현미경 목표렌즈의 수치적 입도(Numerical Aperture, NA)에 제한되지 않고 넓은 분야에서 분해능 이하의 해상도 패턴을 생성하기 위해 탈봇 자기영상 효과(Talbot self-imaging effect)를 활용하는 새로운 구조화된 조명 현미경(SIM) 기법을 제안한다. 특수로 제작된 주기적인 구조 요소를 탈봇 거리의 정수 배수인 반으로 나눈 거리에 위치시킴으로써, 450 × 350 µm 분야에서 500 nm 해상도를 달성하였으며, 이는 현미경 목표렌즈의 2 µm 분해능 한계보다 네 배 향상된 성과이다. 이는 고속 초해상도 형광 현미경을 가능하게 한다.

ABSTRACT

We report a novel extension to structured illumination (SI) microscopy that utilizes the Talbot self-imaging effect to generate a SI pattern on a sample with field-of-view (FOV) and resolution unconstrained by the numerical aperture (NA) of the microscope objective. This enables high-resolution SI pattern generation (up to the free-space propagation limit) across large FOVs, which in turn allows SI microscopy to be efficiently adapted for high-throughput imaging. We demonstrated this concept using a simple prototype microscope to image a large FOV (450 x 350 um) with a diffraction-limited fluorescence resolution limited by the microscope NA to 2 um. A custom-fabricated structured element, designed with periodic spatial features beyond the diffraction limit of the microscope imaging objective, was positioned to within an integer multiple of half the Talbot distance away from the sample. This generated a large FOV, sub-diffraction SI pattern at the sample plane via the Talbot self-imaging effect. Conventional SI super-resolution principles were then used to increase imaging resolution to 500 nm across the complete FOV, roughly a factor of 4 improvement over the microscope NA diffraction limit. This approach should also be applicable for high-throughput sub-diffraction resolution multimodal imaging.

연구 동기 및 목표

• 구조화된 조명 현미경(SIM)에서 전통적인 현미경 목표렌즈의 수치적 입도(Numerical Aperture, NA)에 의해 제한되는 분야 및 해상도 문제를 해결하기 위해.
• 넓은 영역에서 분해능 이하의 해상도를 갖는 구조화된 조명 패턴을 생성하여 고속 초해상도 형광 현미경을 실현하기 위해.
• 탈봇 자기영상 효과를 활용하여 이미징 목표렌즈의 회절 한계를 초월한 공간 주파수 성분을 가진 조명 패턴을 확장하기 위해.
• 이 방법의 실용적이고 프로토타입 기반의 구현을 통해 넓은 분야에서 정량적 해상도 향상을 입증하기 위해.

제안 방법

• 현미경 목표렌즈의 회절 한계 이하인 크기의 주기적인 공간 특징을 가진 특수 제작된 구조 요소를 사용하여 주기적인 조명 패턴을 생성한다.
• 구조 요소를 샘플에서 탈봇 거리의 정수 배수인 반의 거리에 위치시켜 탈봇 자기영상 효과를 유도한다.
• 탈봇 효과는 샘플 평면에서 자기복제되는 고공간주파수 간섭 패턴을 생성하여 넓은 분야에서의 구조화된 조명을 가능하게 한다.
• 자기영상 효과는 목표렌즈의 NA에 관계없이 전체 분야에서 분해능 이하의 해상도 패턴을 생성한다.
• 획득한 영상에 전통적인 SIM 복원 알고리즘을 적용하여 회절 한계를 초월한 초해상도를 달성한다.
• 2 µm 회절 한계를 가진 목표렌즈를 사용한 단순한 프로토타입 현미경을 통해 실험적으로 검증하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 탈봇 자기영상 효과를 활용하여 형광 현미경에서 넓은 분야에서 분해능 이하의 해상도를 갖는 구조화된 조명 패턴을 생성할 수 있는가?
• RQ2 이 방법이 현미경 목표렌즈의 수치적 입도에 의해 제한되는 분야 및 해상도 제약을 극복할 수 있는가?
• RQ3 이 방법이 고해상도 목표(예: 500 nm)를 넓은 분야(예: 450 × 350 µm)에서 일관되게 달성할 수 있는가? 이때 고해상도 목표렌즈가 필요하지 않은가?
• RQ4 탈봇 기반의 구조화된 조명 현미경 기법은 형광 현미경에서 고속 이미징 응용과 호환되는가?
• RQ5 이 방법을 다중모드 및 고속 초해상도 분해능 이미징으로 확장할 수 있는가?

주요 결과

• 탈봇 자기영상 효과는 450 × 350 µm 분야에서 넓은 분야에서 분해능 이하의 해상도를 갖는 구조화된 조명 패턴을 성공적으로 생성하였다.
• 전체 분야에서 500 nm 해상도를 달성하였으며, 이는 현미경 목표렌즈의 2 µm 회절 한계보다 네 배 향상된 성과이다.
• 목표렌즈의 수치적 입도를 증가시키지 않고도 해상도 향상을 달성하였으며, 이는 주기적인 구조 요소의 자기영상 효과에 의존하였다.
• 구조 요소는 이미징 목표렌즈의 회절 한계를 초월하는 크기로 제작되어 고공간주파수 패턴 생성이 가능하였다.
• 자기영상 효과는 탈봇 거리의 반의 정수 배수에서 관측되었으며, 이는 이론적 기반의 타당성을 확인하였다.
• 해상도를 목표렌즈의 NA와 분리함으로써 고속 초해상도 형광 현미경 응용의 실현 가능성을 입증하였다.