[논문 리뷰] Structured Illumination in Spatial-Orientational Hyperspace

Karl Zhanghao, Xingye Chen외 9명|arXiv (Cornell University)|2017. 12. 14.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 14인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 시공간-각도 히퍼스페이스에서 분 dipole를 분석함으로써 형광 극성 현미경에서 공간 정보와 각도 정보를 분리하는 방법인 펄라라이즈드 구조화 조명 현미경(pSIM)을 소개한다. 이는 살아있는 세포에서 세분화된 구조물인 세 cytoskeleton 네트워크, 람다-DNA, 미세소관 등을 초해상도로 이미징할 수 있게 하며, 액틴 링의 조직 구조와 직접적인 동적 dipole 행동을 드러낸다. 이 방법은 상용 및 수제 SIM 시스템과 직접 호환 가능하다.

ABSTRACT

Fluorescence polarization microscopy images both the intensity and orientation of fluorescent dipoles, which plays a vital role in studying the molecular structure and dynamics of bio-complex. However, it is difficult to resolve the dipole assemblies on the subcellular structure and their dynamics in living cells with super-resolution. Here we report polarized structured illumination microscopy (pSIM), which decouples the entangled spatial and angular structured illumination through interpreting the dipoles in spatio-angular hyperspace. We demonstrate its application on a series of biological filamentous systems such as cytoskeleton networks and lambda-DNA, and report the dynamics of short actin sliding through myosin-coated surface. Further, pSIM reveals side-by-side organization of the actin ring structure in the membrane-associated periodic skeleton in hippocampal neurons. It also images the dipole dynamics of green fluorescent proteins labeled to the microtubules in live U2OS cells. pSIM can be applied directly to a large variety of commercial or home-built SIM systems.

연구 동기 및 목표

• 형광 극성 현미경에서 공간 정보와 각도 정보가 얽혀 있는 데 기인한 살아있는 세포 내 분자 조직 구조와 동적 행동을 해소하는 데 도전하는 것.
• 강도와 dipole 정렬 양쪽에서 초해상도를 달성하기 위해 공간적 및 정렬 구조화 조명을 분리하는 방법을 개발하는 것.
• 보다 광범위한 생물학적 영상 응용을 위해 기존 상용 및 수제 SIM 시스템에 직접 적용 가능하도록 하는 것.
• 세세포 골격 네트워크, 람다-DNA, 미세소관과 같은 세포 내 구조를 더 높은 해상도와 정렬 감도로 시각화하는 것.
• 정량적 극성 영상 기법을 사용하여 살아있는 세포에서 액틴 이동과 dipole 재정렬과 같은 동적 과정을 연구하는 것.

제안 방법

• pSIM은 시공간-각도 히퍼스페이스에서 형광 dipole를 해석하여 구조화 조명의 공간적 및 각도적 성분을 분리한다.
• 기존의 구조화 조명 현미경(SIM)을 발전시켜 극성 감도를 통합함으로써 dipole 정렬 정보를 추출한다.
• 수학적 프레임워크를 사용하여 푸리에 도메인에서 공간 주파수와 각도 분포의 기여를 분리한다.
• 이중 채널 검출 방식을 적용하여 강도와 극성 상태를 동시에 캡처함으로써 전체 시공간-각도 복원을 가능하게 한다.
• 재구성 알고리즘은 알려진 dipole 방출 패턴을 활용하여 해상도를 초월하는 정밀도로 정렬과 위치를 해독한다.
• 기존 SIM 하드웨어와 호환되며, 주요 시스템 재설계 없이도 극성 감지 기능을 추가함으로써 간단한 통합이 가능하다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 구조화 조명 현미경은 살아있는 세포에서 공간 정보와 각도(다이폴 정렬) 정보를 동시에 해상도를 높여서 해석할 수 있는가?
• RQ2 세포막에 부착된 주기적 뼈대에서 액틴 필라멘트가 옆으로 배열된 구조가 그 구조적 및 기능적 특성에 미치는 영향은 무엇인가?
• RQ3 녹색 형광 단백질로 표지된 미세소관에서 살아있는 U2OS 세포 내에서 dipole 정렬의 동적 행동은 어떠한가?
• RQ4 pSIM은 미오신 모터에 의해 유도되는 짧은 액틴 이동 사건을 충분한 공간적 및 각도적 정밀도로 해상도를 높여서 분석할 수 있는가?
• RQ5 pSIM은 하드웨어 수정 없이도 기존 상용 또는 맞춤형 SIM 시스템에 얼마나 널리 적용 가능한가?

주요 결과

• pSIM은 해마 뉴런의 세포막에 부착된 주기적 뼈대에서 액틴 필라멘트의 옆으로 배열된 구조를 성공적으로 해상도를 높여 분석하여 이전에 밝혀지지 않은 조직 배열을 드러냈다.
• 이 방법은 미오신으로 코팅된 표면를 가로질러 일어나는 짧은 액틴 이동의 동적 행동을 초초해상도 공간 및 각도 해상도로 시각화했다.
• pSIM은 살아있는 U2OS 세포 내에서 녹색 형광 단백질로 표지된 미세소관의 재정렬 동적 행동을 캡처하여 실시간으로 dipole 행동을 모니터링할 수 있음을 입증했다.
• pSIM은 시공간-각도 히퍼스페이스에서 공간적 정보와 각도 정보를 분리함으로써 세세포 골격 네트워크와 람다-DNA의 초해상도 이미징을 달성했다.
• pSIM은 상용 및 수제 SIM 시스템에 직접 적용 가능하여 하드웨어 전체 교체 없이도 널리 보급 가능함을 입증했다.
• 이 방법은 강도와 dipole 정렬을 동시에 정량적으로 분석할 수 있게 하여 형광 현미경으로부터 추출하는 구조적 및 동적 정보를 크게 향상시켰다.