[논문 리뷰] The effect of shear stress reduction on endothelial cells : a microfluidic study of the actin cytoskeleton

Locatelli, L., Sinha, P.외 1명|arXiv (Cornell University)|2020. 04. 01.

Spaceflight effects on biology참고 문헌 60인용 수 51

한 줄 요약

이 마이크로유체 연구는 0.4에서 0.08 Pa로 벗어난 벽면 전단응력 감소(5배 감소)에 대해 전단응력 적응을 거친 인간 순수막정맥내피세포(HUVECs)가 어떻게 빠르게 액틴 세 cytoskeleton을 재조직하는지 조사한다. 1시간 이내에 세포는 스트레스 섬유를 잃고 액틴을 세포 외곽으로 이동시키며 중심부가 두꺼워지는데, 이는 더 적게 배열되고 더 둥근 형태로 빠르게 표현형 전환됨을 시사한다. 주목할 만한 점은 뉴라미나아제를 이용한 글리코칼릭스 분해가 스트레스 섬유 조직에 영향을 주지 않았다는 점으로, 이는 액틴 재조직화가 주로 기계적 자극에 민감한 반면 글리코칼릭스 의존적이지 않다는 것을 의미한다.

ABSTRACT

Reduced blood flow, as occurring in ischemia or resulting from exposure to microgravity such as encountered in space flights, induces a decrease in the level of shear stress sensed by the endothelial cells forming the inner part of blood vessels. In the present study, we use a microvasculature-on-a-chip device in order to investigate in vitro the effect of such a reduction in shear stress on shear-adapted endothelial cells. We find that, within one hour of exposition to reduced wall shear stress, human umbilical vein endothelial cells undergo a reorganization of their actin skeleton, with a decrease in the number of stress fibers and actin being recruited into the cells' peripheral band, indicating a fairly fast change in cells' phenotype due to altered flow.

연구 동기 및 목표

• 갑작스러운 전단응력 감소에 대한 전단응력 적응을 거친 내피세포의 동적 반응을 조사하기 위해.
• 생리학적으로 관련된 마이크로혈관-칩 시스템에서 혈류력 감소에 대한 액틴 세 cytoskeleton 조직 방식을 규명하기 위해.
• 글리코칼릭스 분해가 전단응력 감소에 대한 세 cytoskeleton 반응에 영향을 미치는지 평가하여, 글리코칼릭스가 기계적 자극 수용체로서의 역할을 하는지 테스트하기 위해.

제안 방법

• 소프트 리소그래피와 폴리디메틸실록세인(PDMS)을 사용하여 16개의 평행된 마이크로채널(가로세로 30×30 µm² 단면)을 갖는 마이크로혈관-칩 장치를 제작하였다.
• 내피세포를 0.4 Pa 전단응력 하에서 96시간 동안 배양하여 동맥경화 억제 표현형을 유도한 후 전단응력 감소를 시행하였다.
• 유량 감소로 전단응력 감소를 5배(0.08 Pa)로 유도하고, 세포 반응을 감소 후 1시간에 이미징하였다.
• 세포는 F-actin과 세포핵에 대해 염색되었으며, 글리코칼릭스는 뉴라미나아제를 사용하여 시알산 잔류기를 타겟으로 분해하였다.
• 형광 이미징 및 액틴 분포, 섬유 각도, 형광 강도의 정량적 분석을 수행하였다.
• 수치 시뮬레이션(CFD)은 1 µL/min 유량에서 장치 전체에 균일한 벽면 전단응력(0.4 ± 0.05 Pa)을 확인하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 0.4 Pa 전단응력에서 적응한 내피세포에서 전단응력 5배 감소가 액틴 세 cytoskeleton 재조직에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ2 전단응력 자극 상실이 내피세포 형태와 세 cytoskeleton 정렬에 대해 빠른 표현형 변화를 유도하는가?
• RQ3 글리코칼릭스가 전단응력 감소 중 스트레스 섬유 조직을 유지하는 데 필수적인가, 아니면 반응이 주로 직접적인 세 cytoskeleton 기계전도에 의해 이끌리는가?
• RQ4 특히 외곽대와 세포체에서 전단응력 감소에 대한 액틴의 공간 분포는 어떻게 변화하는가?
• RQ5 뉴라미나아제에 의한 글리코칼릭스 분해가 전단응력 감소에 대한 세 cytoskeleton 반응에 영향을 미치는가?

주요 결과

• 0.4 Pa에서 0.08 Pa로 전단응력 감소 후 1시간 이내에 HUVECs는 유속 방향에 따라 정렬된 스트레스 섬유를 크게 상실하였다.
• 액틴 재조직화가 급속히 발생하여 F-actin의 중합 증가와 외곽대에 액틴의 이동이 관찰되어 세 cytoskeleton 재조직화가 일어남을 시사하였다.
• 세포체 두께가 뚜렷이 증가하여, 길쭉하고 정렬된 표현형에서 더 둥근 형태로, 더 적은 극성의 형태로의 형태 변화가 일어났음을 나타내었다.
• 뉴라미나아제 처리 후 글리코칼릭스 형광 강도가 현저히 감소했음에도 불구하고, 스트레스 섬유 수량, 방향성, 분포에 유의미한 변화는 관찰되지 않았다.
• 섬유 각도 분포와 액틴의 공간 조직 구조는 대조군과 글리코칼릭스 분해 조건 간에 유의미한 차이가 없었으며, 이는 전단응력 감소에 대한 세 cytoskeleton 반응이 글리코칼릭스의 완전성에 의존하지 않는다는 것을 의미한다.
• 수치 시뮬레이션은 1 µL/min 유량에서 마이크로채널 네트워크 전역에 균일한 벽면 전단응력(0.4 ± 0.05 Pa)이 유지됨을 확인하여 실험 설정의 타당성을 입증하였다.