[논문 리뷰] The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli. Evidence for a new mode of binding for reduced pyridine nucleotides

Vincent Nivière, Franck Fieschi외 2명|PubMed|2015. 01. 07.

Bacterial Genetics and Biotechnology참고 문헌 34인용 수 41

한 줄 요약

이 연구는 대장균의 NAD(P)H:플라빈 산화환원효소(Fre)에서 감소된 피리다인 뉴클레오티드의 새로운 결합 방식을 규명하여, NADPH와 NMNH가 주로 니코틴아미드 고리에 의해 결합함을 입증한다. 효소는 니코틴아미드 고리의 C-4에서 pro-R 수소를 선택적으로 이동시키며, 이는 A-측 특이성 산화환원효소로서의 분류를 확인한다. 이는 일반적인 피리다인 뉴클레오티드 결합 단백질과는 다름없는 고유한 기질 인식을 나타낸다.

ABSTRACT

The NAD(P)H:flavin oxidoreductase from Escherichia coli, named Fre, is a monomer of 26.2 kDa that catalyzes the reduction of free flavins using NADPH or NADH as electron donor. The enzyme does not contain any prosthetic group but accommodates both the reduced pyridine nucleotide and the flavin in a ternary complex prior to oxidoreduction. The specificity of the flavin reductase for the pyridine nucleotide was studied by steady-state kinetics using a variety of NADP analogs. Both the nicotinamide ring and the adenosine part of the substrate molecule have been found to be important for binding to the polypeptide chain. However, in the case of NADPH, the 2'-phosphate group destabilized almost completely the interaction with the adenosine moiety. Moreover, NADPH and NMNH are very good substrates for the flavin reductase, and we have shown that both these molecules bind to the enzyme almost exclusively by the nicotinamide ring. This provides evidence that the flavin reductase exhibits a unique mode for recognition of the reduced pyridine nucleotide. In addition, we have shown that the flavin reductase selectively transfers the pro-R hydrogen from the C-4 position of the nicotinamide ring and is therefore classified as an A-side-specific enzyme.

연구 동기 및 목표

• 대장균의 NAD(P)H:플라빈 산화환원효소(Fre)가 피리다인 뉴클레오티드를 인식하는 분자적 기반을 조사하기 위해.
• NADPH와 NMNH의 다양한 영역이 결합 친화도와 촉매 효율성에 기여하는 정도를 규명하기 위해.
• Fre에 의한 반응에서 수소 이동의 입체화학적 경로를 밝히기 위해.
• 기존의 고전적 뉴클레오티드 결합 단백질과는 다름없는, 감소된 피리다인 뉴클레오티드의 고유한 결합 방식을 규명하기 위해.
• NADPH의 2'-인산기 그룹이 효소에 대한 기질 친화도를 조절하는 데 미치는 영향을 규명하기 위해.

제안 방법

• 기질 특이성과 결합 상호작용을 조사하기 위해 NADP 유사체의 패널을 사용하여 정 steady-state 동역학 분 析를 수행하였다.
• 데우테리움으로 표지된 기질를 사용하여 수소 이동의 입체화학을 분석함으로써 효소의 입체특이성을 평가하였다.
• 동역학 데이터와 알려진 뉴클레오티드 결합 단백질의 구조적 비교를 통해 결합 친화도와 열역학적 파라미터를 유추하였다.
• 핵심 잔기들이 기질 인식에 미치는 역할을 해석하기 위해 변형 및 구조 모델링을 수행하였다. 특히 니코틴아미드 및 아데노신 잔기 부근에서의 기여를 중심으로 분석하였다.
• 회전율과 기질 전환 효율성을 평가하기 위해 자유 플라빈을 전자 수용체로 사용하여 효소의 촉매 활성을 측정하였다.
• NADPH의 2'-인산기 그룹이 아데노신 결합에 미치는 영향을 NMNH 및 NADP 유사체와의 비교 동역학을 통해 체계적으로 평가하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 감소된 피리다인 뉴클레오티드가 대장균 Fre 산화환원효소에 결합하는 데 영향을 주는 분자적 결정 요소는 무엇인가?
• RQ2 NADPH의 2'-인산기 그룹이 기질에 존재함에도 불구하고 아데노신 부분과의 상호작용을 불안정하게 만드는 이유는 무엇인가?
• RQ3 Fre는 니코틴아미드 고리의 C-4 위치에서 수소 이동을 어떻게 입체특이적으로 수행하는가?
• RQ4 NADPH와 NMNH가 아데노신 부분이 아닌 니코틴아미드 고리에 의해 우선적으로 결합되는 구조적 기반은 무엇인가?
• RQ5 Fre의 결합 방식은 다른 피리다인 뉴클레오티드 의존성 산화환원효소와 어떻게 다를까?

주요 결과

• NADPH와 NMNH는 주로 니코틴아미드 고리에 의해 Fre에 결합하며, 아데노신 부분의 기여는 미미하여 고유한 결합 방식임을 시사한다.
• NADPH의 2'-인산기 그룹은 아데노신 영역과의 상호작용을 현저히 불안정하게 하여, NMNH보다 결합 친화도가 낮아진다.
• Fre는 니코틴아미드 고리의 C-4 위치에서 pro-R 수소를 선택적으로 이동시키며, 이는 A-측 특이성 효소로서의 분류를 확인한다.
• Fre는 NADPH와 NMNH 모두에 대해 높은 촉매 효율성을 보이며, 이는 니코틴아미드 고리가 기질 인식의 주요 결정 요소임을 나타낸다.
• 감소된 피리다인 뉴클레오티드의 결합 방식은 일반적으로 아데노신 부분이 주요 역할을 하는 고전적 뉴클레오티드 결합 단백질과는 다름없다.
• 정 steady-state 동역학 분 析를 통해 NMNH의 특이성 상수(kcat/Km)가 NADPH와 유사함을 확인하여, 니코틴아미드 중심의 결합 방식이 기능적으로 중요하다는 것을 뒷받침한다.