[논문 리뷰] Validation of Golden Gate assemblies using highly multiplexed Nanopore amplicon sequencing

Adán Andrés Ramírez Rojas, Cedric K. Brinkmann외 1명|arXiv (Cornell University)|2024. 01. 25.

Genomics and Phylogenetic StudiesBiochemistry, Genetics and Molecular Biology인용 수 3

한 줄 요약

이 논문은 오락스포어 나노포어 시퀀싱을 사용하여 복잡한 골든 게이트 조립체를 검증하기 위해 고다중성, 双바코드 아템플론 시퀀싱 워크플로우를 제시한다. 특히 정의된 검증된 부분들이 아닌 부분 라이브러리를 사용할 경우에 유용하다. 이 방법은 단일 클론에서 직접 고다중성, 비용 효율적이고 빠른 검증을 가능하게 하며, 수동 작업 시간이 최소화되고 시퀀스 오류나 치머리아에 대해 높은 민감도를 보이며 정확하고 해석하기 쉬운 시퀀싱 보고서를 제공한다.

ABSTRACT

Golden Gate cloning has revolutionized synthetic biology. Its concept of modular, highly characterized libraries of parts that can be combined into higher order assemblies allows engineering principles to be applied to biological systems. The basic parts, typically stored in level 0 plasmids, are sequence validated by the method of choice and can be combined into higher order assemblies on demand. Higher order assemblies are typically transcriptional units, and multiple transcriptional units can be assembled into multi-gene constructs. Higher order Golden Gate assembly based on defined and validated parts usually does not introduce sequence changes. Therefore, simple validation of the assemblies, e.g. by colony PCR or restriction digest pattern analysis, is sufficient. However, in many experimental setups, researchers do not use defined parts, but rather part libraries, resulting in assemblies of high combinatorial complexity where sequencing again becomes mandatory. Here we present a detailed protocol for the use of a highly multiplexed dual barcode amplicon sequencing using the Nanopore sequencing platform for in-house sequence validation. The workflow, called DuBA.flow, is a start-to-finish procedure that provides all necessary steps from a single colony to the final easy-to-interpret sequencing report.

연구 동기 및 목표

• 정의된 검증된 부분이 아닌 부분 라이브러리를 사용할 경우 발생하는 고복합성 골든 게이트 조립체의 검증 과제를 해결하기 위해.
• 나노포어 시퀀싱을 활용한 내부에서 실행 가능한 통합 워크플로우를 개발하여 골든 게이트 조립체를 간편하게 검증하기 위해.
• 조합형 합성생물학적 구조체에서 시퀀스 오류, 치머리아, 또는 의도하지 않은 재배열을 고속, 비용 효율적이고 정확하게 탐지하기 위해.
• Sanger 시퀀싱이나 저복합성 방법에 의존하지 않고 단일 클론에서 바로 사용자 친화적이고 쉽게 이해할 수 있는 시퀀싱 보고서를 제공하기 위해.

제안 방법

• 개별 클론과 그 PCR 아템플론을 고유하게 태그하기 위해 고다중성 아템플론 시퀀싱에 이중바코드를 활용한다.
• 복잡한 조립 오류를 탐지하기에 적합한 장독성, 고정밀도 시퀀싱 데이터를 생성하기 위해 옥스포드 나노포어 시퀀싱 기술을 적용한다.
• 샘플을 디멀티플렉싱하고, 리드를 예상되는 구조체에 매핑하며, 시퀀스 변이, 치머리아 또는 돌연변이를 식별하기 위해 커스터마이징된 생정보학 파이프라인을 적용한다.
• 수동 단계를 최소화하고 조합형 골든 게이트 조립체의 빠른 검증을 가능하게 하는 단일 클론에서 보고서까지의 워크플로우를 통합한다.
• 샘플 간 오염을 방지하고 다중화 능력 및 데이터 신뢰성을 향상시키기 위해 이중바코드 전략을 사용한다.
• 최종 보고서는 각 조립 구조체의 정체성과 정확도를 명확히 나타내며, 오류 탐지 및 변이 호출 기능을 포함한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 나노포어 시퀀싱을 활용한 고다중성 이중바코드 아템플론 시퀀싱 접근법이 부분 라이브러리에서 유래한 복잡한 골든 게이트 조립체를 신뢰성 있게 검증할 수 있는가?
• RQ2 이 방법은 Sanger 시퀀싱이나 제한효소 분해와 같은 전통적 검증 기법과 비교해 복합성, 정확도, 오류 탐지 측면에서 어떻게 다른가?
• RQ3 이 워크플로우는 조합형 조립체에서 치머리아 구조체, 점액변이 또는 잘못된 부분 융합을 어느 정도까지 탐지할 수 있는가?
• RQ4 이 방법은 생정보학 전문 지식이 적은 표준 분자생물학 실험실에서 외부 시퀀싱 서비스 없이도 구현 가능한가?

주요 결과

• 이 방법은 한 번의 시퀀싱 런으로 수백 개의 골든 게이트 조립체를 동시에 검증할 수 있어 Sanger 시퀀싱에 비해 복합성 면에서 크게 향상된다.
• 이중바코드 전략은 샘플 간 오염을 효과적으로 방지하고 고다중성 수준에서도 정확한 디멀티플렉싱을 가능하게 한다.
• 이 워크플로우는 클론 PCR이나 제한효소 분해만으로는 발견되지 않았을 복잡한 조립체에서의 시퀀스 오류, 치머리아 융합, 잘못된 부분 조합을 성공적으로 탐지했다.
• 최종 시퀀싱 보고서는 매우 해석하기 쉬우며, 단일 클론에서 바로 구조체 정체성과 정확도에 대한 명확하고 실질적인 데이터를 제공한다.
• 클론 채취에서 최종 보고서까지의 전체 워크플로우는 수동 작업 시간이 최소화되고 표준 장비만으로도 한 실험실에서 완료할 수 있다.
• 이 방법은 저농도 오염 오류나 치머리아에 대해 매우 높은 민감도를 보이며, 고정밀도 합성생물학 응용 분야에 적합하다.