[논문 리뷰] Watching Single Unmodified Enzymes at Work

Cuifeng Ying, Edona Karakaci외 11명|arXiv (Cornell University)|2021. 07. 13.

Protein Structure and Dynamics참고 문헌 40인용 수 9

한 줄 요약

이 연구는 수분 용액 내에서 수정되지 않은 효소의 구조적 변화를 마이크로초 이하의 시간 해상도로 모니터링할 수 있는 플라스모닉스 기반 단일 분자 센싱 기법을 소개한다. 나노구조 금 기반 표면에서 형성된 플라스모닉 핫스팟에 개별 단백질을 갇힘으로써, 아데니late 키나제에서 숨겨진 촉매 서브사이클, 시트르산 합성효소의 기능적으로 중요한 중간체, 헤모글로빈의 단계적 전이, 라벨 없이도 아포칼모듈린의 도메인 특이적 접힘 경로를 밝혀낸다.

ABSTRACT

Many proteins undergo conformational changes during their activity. A full understanding of the function of these proteins can only be obtained if different conformations and transitions between them can be monitored in aqueous solution, with adequate temporal resolution and, ideally, on a single-molecule level. Interrogating conformational dynamics of single proteins remains, however, exquisitely challenging and typically requires site-directed chemical modification combined with rigorous minimization of possible artifacts. These obstacles limit the number of single-protein investigations. The work presented here introduces an approach that traps single unmodified proteins from solution in a plasmonic hotspot and makes it possible to assign changes in refractive index to changes in protein conformation while monitoring these changes for minutes to hours with a temporal resolution at least as fast as 40 microseconds. The resulting single molecule data reveals that adenylate kinase employs a hidden enzymatic sub-cycle during catalysis, that citrate synthase populates a previously unknown intermediate conformation, which is more important for its enzymatic activity than its well-known open conformation, that hemoglobin transitions in several steps from its deoxygenated and rigid T state to its oxygenated and flexible R state, and that apo-calmodulin thermally unfolds and refolds in steps that correspond to conformational changes of individual protein domains.

연구 동기 및 목표

• 특정 부위에 라벨을 부착하는 것이 필요하고 잡음이 발생하는 전통적 단일 분자 연구의 한계를 극복하기 위해.
• 용액 내에서 수정되지 않은 단일 단백질의 장기적이고 고해상도의 구조적 변화를 모니터링할 수 있도록 하기 위해.
• 집합적 또는 수정된 단일 분자 기법으로는 접근이 불가능한, 일시적이고 기능적으로 중요한 단백질 상태를 관찰하기 위해.
• 화학적 수정 없이도 또는 고정화로 인한 잡음 없이 효소 동역학을 연구할 수 있는 일반화 가능한 방법을 확립하기 위해.

제안 방법

• 단백질은 나노구조 금 기반 표면에서 형성된 플라스모닉 핫스팟에 갇히며, 매우 민감한 국소 전자기장을 생성한다.
• 핫스팟 근처의 굴절률 변화는 플라스모닉 공명 이동을 통해 감지되며, 이는 단백질의 구조적 변화와 상관관계가 있다.
• 이 기법은 최소 40 마이크로초의 시간 해상도를 확보하여 수분에서 수시간에 걸친 동역학 관찰이 가능하다.
• 이 방법은 수용액에서 작동하여 천연 단백질 행동을 유지하며, 라벨이나 표면 고정을 피한다.
• 굴절률 변화는 校정 및 제어 실험을 통해 구조 전이와 정량적으로 연결된다.
• 이 시스템은 광분해나 광점멸 현상이 흔한 형광 기반 방법에서 흔히 발생하는 문제 없이 단일 분자를 연속적으로 모니터링할 수 있다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 수용액 내에서 수정되지 않은 효소의 구조적 변화를 실시간으로 고시간 해상도로 모니터링할 수 있는가?
• RQ2 집합적 방법으로는 감지할 수 없는, 효소 촉매 과정 중에 존재하는 숨겨진 또는 일시적인 구조적 상태는 무엇인가?
• RQ3 헤모글로빈과 아포칼모듈린에서 기능적 전이 과정 중 단일 분자 수준에서의 구조 전이가 어떻게 진행되는가?
• RQ4 내재적으로 비정형 또는 모듈식 단백질인 칼모듈린과 같은 단백질에서 단백질 도메인이 얼마나 독립적으로 펴지고 접히는가?
• RQ5 라벨 없이도 플라스모닉 센싱이 시트르산 합성효소나 아데니레이트 키나제와 같은 효소에서 기능적으로 중요한 중간체를 해상도해 낼 수 있는가?

주요 결과

• 아데니레이트 키나제는 이전에 알려지지 않은 촉매 서브사이클을 나타내며, 이는 이전에 알려진 것보다 더 복잡한 동역학 메커니즘을 가짐을 시사한다.
• 시트르산 합성효소는 이전에 알려지지 않은 구조적 중간체를 점유하며, 이는 잘 알려진 개방형 구조보다 더 높은 촉매 활성을 가진다.
• 헤모글로빈은 강성 있는 탈산소화된 T 상태에서 탄성 있는 산소화된 R 상태로의 다단계 전이를 겪으며, 이는 집합적 연구에서 해상도되지 않은 중간 상태를 드러낸다.
• 아포칼모듈린은 도메인별로 단계적으로 펴지고 접히며, 각각의 구조적 도메인에 해당하는 별도의 전이가 관찰된다.
• 이 방법은 수정되지 않은 단일 단백질을 수분에서 수분에서 수시간에 걸쳐 고해상도로 연속적으로 모니터링할 수 있다.
• 관측된 굴절률 변화는 구조 전이와 직접적으로 상관되며, 이는 기술의 구조 변화에 대한 민감도와 특이도를 확인한다.