[논문 리뷰] A watershed-based algorithm to segment and classify cells in fluorescence microscopy images

Lena R. Bartell, Lawrence J. Bonassar외 1명|arXiv (Cornell University)|2017. 06. 02.

Cell Image Analysis Techniques참고 문헌 1인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 형광 현미경 영상에서 세포 자동 분할 및 분류를 위한 사용자 친화적이고 GUI 기반의 워드셔드 분할 알고리즘을 제시한다. 사전 처리, 마커 유도 워드셔드 분할, 임계값 기반 분류를 통합함으로써 정확하고 재현 가능한 결과를 달성한다. 수작업 검증 및 생존도 측정에서의 ROC 분석을 통해 최적의 파rameter 조정이 이루어졌으며, 분류 임계값 1.2에서 95%의 정확도를 입증하였다.

ABSTRACT

Imaging assays of cellular function, especially those using fluorescent stains, are ubiquitous in the biological and medical sciences. Despite advances in computer vision, such images are often analyzed using only manual or rudimentary automated processes. Watershed-based segmentation is an effective technique for identifying objects in images; it outperforms commonly used image analysis methods, but requires familiarity with computer-vision techniques to be applied successfully. In this report, we present and implement a watershed-based image analysis and classification algorithm in a GUI, enabling a broad set of users to easily understand the algorithm and adjust the parameters to their specific needs. As an example, we implement this algorithm to find and classify cells in a complex imaging assay for mitochondrial function. In a second example, we demonstrate a workflow using manual comparisons and receiver operator characteristics to optimize the algorithm parameters for finding live and dead cells in a standard viability assay. Overall, this watershed-based algorithm is more advanced than traditional thresholding and can produce optimized, automated results. By incorporating associated pre-processing steps in the GUI, the algorithm is also easily adjusted, rendering it user-friendly.

연구 동기 및 목표

• 컴퓨터 시각 전문 지식이 없는 생물의학 연구자들이 접근할 수 있는 고급 이미지 분석 도구의 부족을 해결하기 위해.
• 형광 현미경 영상에서 세포 정량화의 수동 편향을 줄이고 처리량을 증가시키기 위해.
• 사전 처리 및 마커 유도를 통해 과분할을 방지하는 투명하고 조정 가능한 워드셔드 기반 분할 파이프라인을 개발하기 위해.
• 수작업 검증 및 수신기 작동 특성(ROC) 분 析를 통해 분할 및 분류 파rameter를 최적화하기 위해.
• 사용자에게 친화적인 애플리케이션을 제공하기 위해 사전 처리, 분할, 후처리를 통합한 무료로 이용 가능한 MATLAB 기반 GUI 도구를 제공하기 위해.

제안 방법

• 워드셔드 분할 이전에 노이즈 감소 및 대trast 향상을 위해 가우시안 필터링과 중앙값 필터링을 적용한다.
• 지역 강도 최대값 기반으로 지역 최소값을 정의함으로써 과분할을 방지하기 위해 마커 제어 워드셔드 분할을 사용한다.
• 일관된 분할을 위해 배경 강화 단계를 도입하여 다양한 영상 강도에서의 분할 일관성을 확보한다.
• 크기 임계값 기반으로 소형 잡음 객체를 제거하기 위해 분할 결과를 후처리한다.
• 세포는 빨간색 및绿色通道의 평균 형광 강도를 사용한 비율 기반 함수 f = mean(R)/mean(G)를 통해 분류된다.
• 최적의 분류 임계값은 100개의 세포를 수작업으로 레이블링한 부분집합에 대해 ROC 분 析를 통해 결정되었으며, 이는 진성 양성 및 음성 비율을 최대화한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 비전문가 생물의학 연구자들이 워드셔드 기반 분할 알고리즘을 쉽게 사용할 수 있는가?
• RQ2 사전 처리 및 마커 유도는 복잡한 형광 현미경 영상에서 워드셔드 분할 정확도를 향상시키고 과분할을 어떻게 줄일 수 있는가?
• RQ3 이중 색채 생존도 측정에서 강도 비율 분석을 사용할 때 살아있는 세포와 죽은 세포를 분류하기 위한 최적의 임계값은 무엇인가?
• RQ4 ROC 최적화 파rameter 조정은 수작업 또는 단순 임계값 기반 방법에 비해 분류 정확도를 얼마나 향상시키는가?
• RQ5 분할, 분류, 검증을 통합한 통합된 사용자 조정 가능한 파이프라인을 다양한 형광 영상 분석에 적용할 수 있는가?

주요 결과

• GUI 기반 워드셔드 알고리즘은 특히 겹치는 세포가 많은 복잡한 영상에서 전통적인 임계값 기반 방법에 비해 분할 정확도를 크게 향상시켰다.
• 최적의 분할은 가우시안 필터링(σ = 1.5), 중앙값 필터링(커널 크기 = 5), 배경 강화의 조합을 통해 달성되었으며, 거짓 양성 수를 감소시켰다.
• 생존도 측정에서 분류 함수 f = mean(R)/mean(G)는 임계값 1.2에서 최대 정확도를 보였으며, 수작업으로 레이블링한 100개 세포의 부분집합에 대한 ROC 분 析 결과 95%의 정확도를 기록했다.
• 이 방법은 비연속적인 염색 패atters를 가진 삼색 미토콘드리아 기능 측정에서도 세포를 성공적으로 분할 및 분류하여 강건성을 입증했다.
• 사전 처리, 분할, 후처리 단계를 하나의 GUI에 통합함으로써 사용자는 스크립팅 없이도 파arameter를 반복적으로 조정하고 최적의 결과를 도출할 수 있었다.
• 수작업 비교 및 통계 분석을 통해 알고리즘의 성능이 고처리량 자동 이미지 분석에 신뢰할 수 있음을 확인하였다.