[논문 리뷰] Biological Averaging in RNA-Seq

Surojit Biswas, Yash Agrawal외 3명|arXiv (Cornell University)|2013. 09. 03.

Gene expression and cancer classification참고 문헌 23인용 수 13

한 줄 요약

이 논문은 생물학적으로 평균화된 RNA-Seq 실험, 즉 여러 개체의 mRNA를 시퀀싱 이전에 혼합한 경우를 대상으로 하는 비모수적 차등 발현 분류기인 ICRBC를 제안한다. ICRBC는 LOESS 스무딩을 통한 이질분산 추정을 사용하여 표준 방법(예: edgeR)과 높은 일치도(87–95%)를 보이며, 특히 샘플 풀링이 균일하고 조절 유전자 조절체의 20% 미만일 경우, 최대 50% 적은 시퀀싱 데이터로도 비용 효율적인 대안을 제공한다.

ABSTRACT

RNA-seq has become a de facto standard for measuring gene expression. Traditionally, RNA-seq experiments are mathematically averaged -- they sequence the mRNA of individuals from different treatment groups, hoping to correlate phenotype with differences in arithmetic read count averages at shared loci of interest. Alternatively, the tissue from the same individuals may be pooled prior to sequencing in what we refer to as a biologically averaged design. As mathematical averaging sequences all individuals it controls for both biological and technical variation; however, is the statistical resolution gained always worth the additional cost? To compare biological and mathematical averaging, we examined theoretical and empirical estimates of statistical efficiency and relative cost efficiency. Though less efficient at a fixed sample size, we found that biological averaging can be more cost efficient than mathematical averaging. With this motivation, we developed a differential expression classifier, ICRBC, that can detect alternatively expressed genes between biologically averaged samples. In simulation studies, we found that biological averaging and subsequent analysis with our classifier performed comparably to existing methods, such as ASC, edgeR, and DESeq, especially when individuals were pooled evenly and less than 20% of the regulome was expected to be differentially regulated. In two technically distinct mouse datasets and one plant dataset, we found that our method was over 87% concordant with edgeR for the 100 most significant features. We therefore conclude biological averaging may sufficiently control biological variation to a level that differences in gene expression may be detectable. In such situations, ICRBC can enable reliable exploratory analysis at a fraction of the cost, especially when interest lies in the most differentially expressed loci.

연구 동기 및 목표

• 생물학적 평균화와 수학적 평균화의 통계적 효율성과 비용 효율성을 RNA-Seq 실험에서 평가하는 것.
• 개별 복제 샘플이 시퀀싱 이전에 혼합되는 생물학적 평균화 설계에 특화된 강력한 차등 발현 분류기인 ICRBC를 개발하는 것.
• ICRBC의 성능을 edgeR, ASC, DESeq와 같은 기존 방법들과 비교하여 다양한 풀링 조건과 생물학적 변동 수준에서 평가하는 것.
• 생물학적 평균화와 ICRBC를 조합하여 전통적인 수학적 평균화 RNA-Seq 실험에 비해 통계적으로 타당하고 비용 효율적인 대안이 되는 조건을 규명하는 것.
• 특히 가장 유의미한 차등 발현 유전자에 대해 ICRBC의 정확도를 실증적 데이터와 시뮬레이션 기반으로 검증하는 것.

제안 방법

• ICRBC는 로그 발현 차이의 이질분산 함수를 추정하기 위해 비모수적 LOESS 스무딩 절차를 사용하여 발현 분포에 대한 모수적 가정을 피한다.
• 이 방법은 평균 발현 수준을 고려할 때 예상치 못한 큰 로그 발현 차이로 차등 발현을 정의하며, 신뢰 영역 기반 분류 프레임워크를 사용한다.
• ICRBC는 평균 발현에 조건을 두어 로그 비율 차이의 귀무분포를 모델링하며, 게놈 전역의 발현 패턴을 활용하여 분산 추정을 향상시킨다.
• 시뮬레이션 연구를 통해 다양한 샘플 크기, 풀링 균형도, 차등 조절 유전자 비율(최대 20%) 조건에서 검증한다.
• 두 마우스 및 한 개의 식물 RNA-Seq 데이터셋에서 실 데이터를 ICRBC로 분석하고, edgeR 및 ASC와 비교하여 일치도와 FDR 성능을 평가한다.
• 생물학적 평균화 설계와 수학적 평균화 설계 간의 파wr, FDR, 시퀀싱 비용을 비교하여 통계적 효율성과 상대적 비용 효율성을 평가한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 RNA-Seq 실험에서 생물학적 평균화가 수학적 평균화보다 언제 더 비용 효율적인가?
• RQ2 풀링 균형도가 생물학적 평균화 설계에서 차등 발현 탐지의 통계적 검정력과 정확도에 어떤 영향을 미치는가?
• RQ3 ICRBC와 같은 비모수적 분류기는 ASC와 같은 모수적 방법보다 풀링된 RNA-Seq 데이터에서 차등 발현 유전자 탐지에 있어 유사하거나 더 뛰어난 성능을 낼 수 있는가?
• RQ4 ICRBC가 생물학적 평균화 실험에서 고정밀도와 낮은 FDR을 유지할 수 있는 최대 차등 조절 유전자 비율은 얼마인가?
• RQ5 기술적 및 생물학적 변동성이 다양한 실제 데이터셋에서 ICRBC의 성능은 edgeR(황금 표준)와 비교해 어떻게 되는가?

주요 결과

• 두 마우스 및 한 개의 식물 데이터셋에서 ICRBC는 가장 유의미한 100개의 차등 발현 유전자에 대해 edgeR과 87% 이상의 일치도를 보이며, 상위 유전자에 대한 강력한 신뢰성을 입증했다.
• 시뮬레이션 결과, ICRBC는 10명 이상의 개체가 균일하게 풀링된 경우 FDR이 0.001일 때 약 75%의 차등 발현 유전자를 탐지하여 높은 민감도를 보였다.
• 시뮬레이션과 실데이터 모두에서 ICRBC는 ASC를 능가했으며, 특히 비균형 풀링 조건에서 ASC는 변동성이 크고 정확도가 떨어지는 경향을 보였다.
• 생물학적 변동성이 높고 풀링이 균일할 경우, 생물학적 평균화가 수학적 평균화보다 통계적으로 더 비용 효율적인 것으로 밝혀졌으며, 특히 조절체의 20% 미만이 차등 조절될 경우에 특히 유리했다.
• ICRBC의 비모수적 LOESS 기반 분산 추정은 ASC의 모수적 이동 지수 분포 가정보다 더 잘 이질적인 게놈 전역 발현 분포를 반영했으며, 특히 관측된 이중모드 발현 패턴을 반영하지 못하는 경향이 있는 ASC보다 우수했다.
• Bottomly 데이터셋에서 ICRBC는 상위 4,160개의 유전자에 대해 edgeR과 95% 이상의 일치도를 유지하여, 매우 유의미한 유전자 탐색 분석에서 뛰어난 성능을 보였다.