[논문 리뷰] Design and applications of a fluorescent labeling technique for lipid and surfactant preformed vesicles

Fanny Mousseau, Jean‐François Berret외 1명|arXiv (Cornell University)|2019. 06. 04.

Lipid Membrane Structure and Behavior인용 수 4

한 줄 요약

이 논문은 정제 또는 분리 단계 없이 전형적인 지질 및 계면활성제 미세구조를 형성한 지질 이중층에 침투하는 지질 친화성 카보시아닌 염료 PKH67를 사용하여 간단하고 보편적인 형광 표지 기법을 제시한다. 이 방법은 실시간으로 세포막 및 고체 표면과의 미세구조 상호작용을 관찰할 수 있게 하며, 약물 전달 및 섬유 연출제 응용 분야에서 높은 특이성과 최소한의 샘플 간섭을 보여준다.

ABSTRACT

Amphiphilic molecules such as surfactants, lipids and block copolymers can be assembled into bilayers and form vesicles. Fluorescent membrane labeling methods require the use of dye molecules that can be inserted in the bilayers at different stages of the synthesis. To our knowledge there is no generalized method for labeling preformed vesicles. Herein we develop a versatile protocol that is suitable to both surfactant and lipid preformed vesicles and requires no separation or purification steps. Based on the lipophilic carbocyanine green dye PKH67, the methodology is assessed on zwitterionic phosphatidylcholine vesicles. To demonstrate its versatility, it is applied to dispersions of anionic or cationic vesicles, such as a drug administrated to premature infants with respiratory distress syndrome, or a vesicle formulation used as a fabric softener for homecare applications. By means of fluorescence microscopy we then visualize the interaction mechanisms of nanoparticles crossing live cell membranes and of surfactant adsorbing on cotton fabric. These results highlight the advantages of a membrane labeling technique that is simple and applicable to a large number of soft matter systems.

연구 동기 및 목표

• 정제 또는 분리 단계 없이 일반화된 형광 표지 방법을 개발하기 위해.
• 생물학적 및 산업 제형을 포함한 복잡한 연질 물질 시스템에서의 미세구조 역학을 관찰하기 위해.
• 이온성, 음성, 양성 시스템을 포함한 다양한 유형의 미세구조에서의 기술 유효성 검증을 위해.
• 신생아 호흡기 증후군 치료제 및 섬유 연출제와 같은 생물학적 및 산업적 응용 분야에서의 적용 가능성을 입증하기 위해.
• 실시간 관찰이 가능한 형광 현미경과 호환되는 견고하고 확장 가능한 표지 프로토콜을 제공하기 위해.

제안 방법

• 지질 및 계면활성제 이중층에 자발적으로 분포하는 지질 친화성 카보시아닌 녹색 염료인 PKH67의 활용.
• 정제 또는 분리 과정 없이 사전 형성된 미세구조 분산액에 PKH67 직접 첨가.
• 염료가 이중층 내에서 평형을 이룰 수 있도록 제어된 조건에서 배양.
• 형광 현미경을 활용해 생세포막 전이 및 표면 흡착 실험에서 표지된 미세구조를 모니터링.
• 표면 전하가 다른 미세구조(양성, 음성, 비극성)에 대한 표지 프로토콜 적용을 통해 유연성 테스트.
• 형태학적 및 형광 분석을 통한 표지 효율성과 미세구조의 구조적 안정성 유지 여부 검증.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 정제 또는 분리 단계 없이 보편적인 형광 표지 방법을 사전 형성된 미세구조에 적용할 수 있는가?
• RQ2 PKH67가 다양한 표면 전하를 지닌 미세구조, 특히 음성 및 양성 시스템에 얼마나 효과적으로 표지되는가?
• RQ3 이 표지 기법이 생물학적 및 산업 환경에서 미세구조의 구조적 안정성과 기능성을 얼마나 잘 유지하는가?
• RQ4 표지된 미세구조를 사용하여 생세포막 및 고체 표면과의 실시간 상호작용을 관찰할 수 있는가?
• RQ5 이 방법이 약물 전달 및 가정용 제품 제형을 포함한 다양한 연질 물질 시스템에 얼마나 넓게 적용 가능한가?

주요 결과

• PKH67 표지 기법은 정제 또는 분리 단계 없이 양성, 음성, 비극성 유형의 사전 형성된 미세구조를 효과적으로 표지하였다.
• 형광 현미경을 통해 효율적이고 안정적인 표지가 확인되어 생세포막과의 상호작용을 실시간으로 관찰할 수 있었다.
• 이 기법을 통해 세포막을 통과하는 나노입자의 전이 과정을 직접 관찰할 수 있었으며, 내포 작용 및 비내포 작용 경로를 밝혀냈다.
• 표지된 계면활성제 미세구조는 면직물에 효과적으로 흡착되어 가정용 제품 응용 분야의 유용성을 입증하였다.
• 일관된 형광 강도와 입자 크기 분포를 통해 표지 후에도 미세구조의 형태와 기능이 유지됨을 확인하였다.
• 이 표지 프로토콜은 신생아 호흡기 증후군 치료제 제형과 상업용 섬유 연출제를 포함한 다수의 시스템에서 유효성이 검증되었다.