[논문 리뷰] Efficient wide-field FLIM

Adam J. Bowman, Brannon B. Klopfer외 2명|arXiv (Cornell University)|2018. 12. 17.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 52인용 수 12

한 줄 요약

이 논문은 나노초 시간 해상도와 높은 광자 효율성을 갖춘 Pockels 셀 기반 광학적 폭넓은 분야 형광 수명 영상(FLIM) 기술을 제시한다. 이는 카메라 프레임 속도에서 단일 프레임 FLIM을 가능하게 한다. Pockels 셀을 편광 분리기와 재이미징 캐비티와 조합함으로써, 시간에 따른 단일 광자 수색 방식(TC-SPC)보다 10³–10⁵배 높은 효율을 달성하여, 다중 레이블 FLIM, 단일 분자 스펙트로스코피, 게이팅 손실 없이 동적 영상 촬영을 지원한다.

ABSTRACT

Nanosecond temporal resolution enables new methods for wide-field imaging like time-of-flight, gated detection, and fluorescence lifetime. The optical efficiency of existing approaches, however, presents challenges for low-light applications common to fluorescence microscopy and single-molecule imaging. We demonstrate the use of Pockels cells for wide-field image gating with nanosecond temporal resolution and high photon collection efficiency. Two temporal frames are obtained by combining a Pockels cell with a pair of polarizing beam-splitters. We show multi-label fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), single-molecule lifetime spectroscopy, and fast single-frame FLIM at the camera frame rate with $10^3 - 10^5$ times higher throughput than single photon counting. Finally, we demonstrate a space-to-time image multiplexer using a re-imaging optical cavity with a tilted mirror to extend the Pockels cell technique to multiple temporal frames. These methods enable nanosecond imaging with standard optical systems and sensors, opening a new temporal dimension for low-light microscopy.

연구 동기 및 목표

• 기존 광학적 폭넓은 나노초 해상도 영상 기술의 낮은 광자 효율성과 처리 능력의 한계를 극복하기 위해.
• 표준 카메라와 광학 부품을 사용하여 나노초 시간 해상도를 갖춘 고감도 광학적 폭넓은 FLIM을 실현하기 위해.
• 이미지 품질을 훼손시키지 않으면서 사라짐 없이, 사라짐 없이 단일 프레임 및 다중 프레임 FLIM을 위한 광자 효율적이고 사라짐 없는 방법을 개발하기 위해.
• 재이미징 광학 캐비티를 사용하여 Pockels 셀 게이팅 기술을 다중 시간 영상으로 확장하여 시간-공간 다중화를 실현하기 위해.

제안 방법

• Pockels 셀을 사용하여 전기장에 의존하는 지연을 조절함으로써 광학적 폭넓은 형광 방출의 편광을 조절함으로써 나노초 시간 게이팅을 실현한다.
• Pockels 셀 후에 두 개의 편광 분리기(PBS)가 빛을 나누어, 게이팅 펄스 이전과 이후의 시간적 강도 차이를 인코딩한 네 개의 출력 영상이 생성된다.
• Pockels 셀에 단계 함수 또는 가우시안 전압 펄스를 적용하여 두 개의 시간 영역를 생성하며, 두 출력 채널의 강도 비율을 사용하여 형광 수명을 계산한다.
• 기울인 거울을 갖춘 재이미징 광학 캐비티를 사용하여 영상이 여러 번 반사되어 다중 시간 영상이 생성되며, 왕복 시간 t_rt = 8f/c가 영상 간격을 결정한다.
• 이 방법은 30 mm의 KD*P Pockels 셀을 사용하며, 4.5 ns의 상승 시간과 80%의 게이팅 효율성을 갖추고 있으며, IRF 校정을 위해 비스플리터를 사용하여 기구 반응 함수를 보정한다.
• 수명 계산은 측정된 강도 비율과 사전 캐릭터라이즈된 IRF를 기반으로 한 룩업 테이블을 사용하며, 오차 분석은 셸드 노이즈와 배경 기여를 고려한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 Pockels 셀 기반 시스템은 낮은 광자 수집 효율성과 함께 광학적 폭넓은 분야에서 나노초 시간 해상도를 달성할 수 있는가?
• RQ2 이 기술은 사라짐 없이 또는 게이팅 손실 없이 카메라 프레임 속도에서 단일 프레임 FLIM을 실현할 수 있는가?
• RQ3 재이미징 캐비티를 사용하여 Pockels 셀 기술을 다중 시간 영상으로 확장하여 다중 프레임 초고속 영상 촬영이 가능한가?
• RQ4 기존의 TC-SPC 및 게이팅 영상 시스템과 비교해 광자 효율성과 신호 대 잡음 성능은 어떻게 되는가?
• RQ5 장거리 시야에서 기구 반응 함수의 공간적 변동이 수명 정확도에 얼마나 영향을 미치는가?

주요 결과

• Pockels 셀 시스템은 시간에 따른 단일 광자 수색 방식(TC-SPC)보다 10³–10⁵배 높은 처리 능력을 갖추며, 카메라 프레임 속도에서 단일 프레임 FLIM을 실현한다.
• 이 방법은 효율적인 다중 레이블 FLIM, 단일 분자 수명 스펙트로스코피, 게이팅 손실이나 기존 게이팅과 관련된 노이즈 없이 동적 FLIM을 가능하게 한다.
• 30 mm의 KD*P Pockels 셀은 4.5 ns 상승 시간과 80% 게이팅 효율성을 갖추며, 6 mrad의 반구형 수용각 내에서 고정밀 시간 해상도를 제공한다.
• f = 150 mm이고 t_rt = 4.0 ns인 재이미징 캐비티는 시간을 공간 채널에 다중화함으로써 n-프레임 영상 촬영을 가능하게 하여 기술을 다중 시간 영역로 확장한다.
• 수명 측정 결과, 특히 넓은 시야에서 기구 반응 함수의 공간적 변동으로 인해 위치에 따라 오차가 발생하며, 분석 과정에서 이를 보정한다.
• 크래머-라오 경계 분석을 통해 이 방법이 거의 최적의 광자 효율성을 달성하며, 정규화된 불확실성은 시간 영역 수와 통합 시간에 따라 유리하게 스케일링됨을 확인한다.