[논문 리뷰] Hierarchical clustering of DNA k-mer counts in RNA-seq fastq files reveals batch effects

Wolfgang Kaisers, Holger Schwender외 1명|arXiv (Cornell University)|2014. 05. 01.

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한 줄 요약

이 논문은 원시 RNA-seq Fastq 파일에서 DNA k-mer 수를 계층적 군집화하는 HcKmer라는 방법을 제안한다. 이 방법은 정렬 또는 사전 지식 없이도 배치 효과를 탐지할 수 있다. 8개의 Illumina Flowcell에서 온 61개 샘플의 k-mer 빈도(정규화된 k=9)를 분석한 결과, 21%의 Flowcell 비교에서 강한 배치 효과를 확인했으며, 이는 품질 필터링 및 게놈 정렬 후에도 지속됨을 보여, 이는 시퀀싱 오류나 저품질 리드 때문이 아니라는 것을 시사한다.

ABSTRACT

Batch effects, artificial sources of variation due to experimental design, are a widespread phenomenon in high throughput data. Therefore, mechanisms for detection of batch effects are needed requiring comparison of multiple samples. We apply hierarchical clustering (HC) on DNA k-mer counts of multiple RNA-seq derived Fastq files. Ideally, HC generated trees reflect experimental treatment groups and thus may indicate experimental effects, but clustering of preparation groups indicates the presence of batch effects. In order to provide a simple applicable tool we implemented sequential analysis of Fastq reads with low memory usage in an R package (seqTools) available on Bioconductor. DNA k-mer counts were analysed on 61 Fastq files containing RNA-seq data from two cell types (dermal fibroblasts and Jurkat cells) sequenced on 8 different Illumina Flowcells. Results: Pairwise comparison of all Flowcells with hierarchical clustering revealed strong Flowcell based tree separation in 6 (21 %) and detectable Flowcell based clustering in 17 (60.7 %) of 28 Flowcell comparisons. In our samples, batch effects were also present in reads mapped to the human genome. Filtering reads for high quality (Phred >30) did not remove the batch effects. Conclusions: Hierarchical clustering of DNA k-mer counts provides a quality criterion and an unspecific diagnostic tool for RNA-seq experiments.

연구 동기 및 목표

• 표준 품질 관리 방법으로는 포착되지 않는 RNA-seq 실험의 배치 효과를 탐지하기 위해.
• 계층적 군집화된 DNA k-mer 수를 활용해 고-throughput 시퀀싱 데이터의 기술적 변동성에 대한 비지도 진단 도구로 활용할 수 있는지 평가하기 위해.
• 배치 효과가 후속 차등 발현 분석에 미치는 영향과 품질 필터링 및 정렬 이후에도 지속되는지 평가하기 위해.
• 배치 효과가 몇몇 과도하게 빈도가 높은 k-mers 때문인지, 아니면 많은 k-mers들 사이의 광범위한 소규모 편차 때문인지 파악하기 위해.

제안 방법

• k=9를 사용하여 원시 Fastq 파일에서 DNA k-mer 수를 추출하여, 각 시퀀스당 최대 262,144개의 k-mers를 생성한다.
• 정규화된 k-mer 수 벡터 간의 쌍별 이질성 정도를 측정하기 위해 Canberra 거리를 적용한다.
• 시퀀싱 깊이의 차이를 보정하기 위해 총 리드 수를 동일한 값으로 스케일링한다.
• 거리 행렬에 대해 hclust 함수를 사용하고 평균 연결법을 적용하여 계층적 군집화를 수행한다.
• 원시 Fastq 파일, Phred 점수 필터링된 시퀀스(Phred > 30), 인간 게놈(GRCh38)에 정렬된 리드 간의 군집 결과를 비교한다.
• k=6를 사용한 시뮬레이션 연구를 통해 메서드의 배치 효과 탐지 민감도를 평가한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 계층적 군집화된 k-mer 수는 표준 품질 관리 방법으로는 드러나지 않는 RNA-seq Fastq 파일의 배치 효과를 탐지할 수 있는가?
• RQ2 고 Phred 점수 필터링 및 인간 게놈에 대한 정렬 이후에도 배치 효과는 얼마나 지속되는가?
• RQ3 배치 효과는 소수의 과도하게 빈도가 높거나 낮은 k-mers 때문인지, 아니면 많은 k-mers들 사이의 광범위한 소규모 편차 때문인가?
• RQ4 배치 효과는 후속 차등 발현 분석에 어떤 영향을 미치며, 특히 잘못된 발견률(FDR) 측면에서 어떻게 영향을 미치는가?
• RQ5 HcKmer는 다중 Flowcell RNA-seq 실험에서 실험적 효과와 기술적 배치 효과를 신뢰성 있게 구분할 수 있는가?

주요 결과

• 28개의 Flowcell 비교 중 6개(21%)에서 k-mer 수의 계층적 군집화가 서로 다른 Flowcell에 해당하는 강한 분리 구조를 보였으며, 이는 상당한 배치 효과를 시사한다.
• 28개 비교 중 17개(60.7%)에서 Flowcell에 따른 감지 가능한 군집화가 관찰되어, 데이터셋 전반에 걸쳐 배치 효과가 널리 퍼져 있음을 시사한다.
• Phred 점수 > 30로 리드를 필터링한 후에도 배치 효과가 지속되어, 이는 저품질 시퀀싱 때문이 아니라는 것을 시사한다.
• 인간 게놈에 정렬된 리드에서도 배치 효과가 관찰되어, 정렬 과정에서 배치 효과가 제거되지 않음을 보여준다.
• 수목 분리 원인이 된 k-mers 스펙트럼은 소수의 극단적인 외곽값이 아니라, 평균 차이가 0.30인 log10-정규화된 수치를 가지는 넓은 분포의 k-mers들에서 발생하며, 이는 소규모에서 중간 정도의 차이를 보인다.
• HcKmer는 개별 k-mers의 검사를 통해서는 탐지되지 않는 배치 효과를 진단했으며, 3% 오염률에 도달하기 위해 3,600개 이상의 k-mers가 가장 큰 차이를 보여야 함을 보여준다.