[논문 리뷰] High Speed Two-Photon Lifetime Imaging

Sebastian Karpf, Bahram Jalali|arXiv (Cornell University)|2017. 09. 02.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques인용 수 2

한 줄 요약

이 논문은 파장 스위프 레이저와 각도 분산를 통한 관성 없는 빔 스텝 기술을 사용하여 1초당 8800만 픽셀의 고속 이중광자 수명 영상 시스템을 제시한다. 이 시스템은 단일 광자 감도를 갖춘 킬로헤르츠 프레임 레이트를 달성하여 실시간으로 회절한계에 도달하는 형광 및 FLIM 영상 촬영을 가능하게 하며, 이미지 보조 세포 분류와 같은 고속 처리 응용 분야에 적합하다.

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

연구 동기 및 목표

• 기계적 스캐너에 의해 제한되는 전통적인 이중광자 현미경의 속도 한계를 극복한다. 일반적으로 기계적 스캐너로 인해 1초당 10~100 프레임으로 제한된다.
• 역동적인 생물학적 과정과 고속 처리 응용 분야를 위해 고속, 고대역폭 형광 수명 영상(FLIM)을 가능하게 한다.
• 빠른 빔 스텝과 고대역폭 검출 기능을 갖춘 디지털 재구성 가능한 영상 시스템을 개발하여 예상치 못한 높은 촬영 속도를 달성한다.
• 관성 없는 빔 스텝을 위해 퉁성 레이저와 각도 분산를 통합하여 기계적 스캐닝 지연을 제거한다.
• 킬로헤르츠 프레임 레이트와 단일 광자 감도를 달성하여 살아있는 세포와 조직에서 고감도, 고해상도 수명 영상 촬영을 가능하게 한다.

제안 방법

• 고반복 주기와 조절 가능한 중심 파장을 갖춘 펄스 변조형 빠른 파장 스위프 레이저를 사용하여 자극 펄스를 생성한다.
• 기계적 구성 요소 없이 각도 분산를 사용하여 레이저 빔을 스위치하여 관성 없는 고속 빔 스캐닝을 실현한다.
• 고대역폭, 단일 광자 감도가 있는 검출기를 구현하여 고시간 해상도로 형광 감쇠 신호를 캡처한다.
• 스위프 레이저 소스와 디지털 재구성 가능한 영상 시스템을 조합하여 실시간, 다중 모드 이중광자 형광 및 FLIM 영상 촬영을 가능하게 한다.
• 고속 처리 픽셀 레이트(1초당 8800만 픽셀)를 처리할 수 있는 데이터 수집 시스템을 활용하여 실시간 수명 분석을 지원한다.
• 시스템의 재구성 가능성을 활용하여 정적 영상 촬영과 영상 유체세포 측정 응용 분야 모두를 지원한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 파장 스위프 레이저와 각도 분산는 기계적 스캐닝 없이도 이중광자 현미경에서 킬로헤르츠 프레임 레이트를 달성할 수 있는가?
• RQ2 고대역폭, 단일 광자 감도가 있는 검출기로 이중광자 FLIM에서 얻을 수 있는 최대 픽셀 촬영 속도는 얼마인가?
• RQ3 초고속으로 작동할 때도 회절한계 해상도와 분자 특이성을 유지할 수 있는가?
• RQ4 디지털 재구성 가능한 레이저와 데이터 수집 시스템의 통합은 이미지 보조 세포 분류와 같은 고속 처리 영상 촬영 응용 분야를 어떻게 가능하게 하는가?
• RQ5 100 프레임/초를 초과하는 프레임 레이트에서도 고감도 및 고시간 해상도를 유지할 수 있는가?

주요 결과

• 시스템은 기록적인 촬영 속도인 1초당 8800만 픽셀을 달성하여 실시간 고속 처리 이중광자 영상 촬영을 가능하게 한다.
• 빠른 파장 스위프 레이저와 각도 분산를 활용한 관성 없는 빔 스텝 기술을 통해 기계적 스캐닝 제한을 제거하고 킬로헤르츠 프레임 레이트를 달성한다.
• 고감도 및 고해상도로 회절한계에 도달하는 다중 모드 이중광자 형광 및 형광 수명 영상(FLIM)을 지원한다.
• 고대역폭 단일 광자 검출은 초고속 프레임 레이트에서도 정밀한 수명 측정을 가능하게 한다.
• 디지털 재구성 가능한 레이저와 영상 시스템은 정적 영상 촬영과 영상 유체세포 측정 모드 모두에서의 융통성 있는 운영을 가능하게 한다.
• 빠른 촬영 속도와 분자 특이성, 세포 내부 해상도를 결합하여 고속 이미지 보조 세포 분류를 가능하게 한다.