[논문 리뷰] Methods to calibrate and scale axial distances in confocal microscopy as a function of refractive index

Thijs H. Besseling, Jissy Jose외 1명|arXiv (Cornell University)|2014. 04. 15.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 1인용 수 10

한 줄 요약

이 논문은 굴절률(RI) 불일치와 벡터성 빛 효과를 고려하여 3D 공형 현미경에서 축 방향 거리를 校정하기 위한 두 가지 실용적이고 정확한 방법을 제시한다. 유리 세포 내에서 파르티-페로르 간섭 기반 높이 측정과 큰 형광 코팅을 가진 미세구를 사용하여, 축 방향 스케일링 인자가 RI에 선형적으로 의존하며, 기하광학의 예측과는 다르게 전체 벡터성 빛 이론과 밀접하게 일치함을 입증한다. 또한, 미세구의 렌즈 효과로 인해 미세한 구형 입자는 RI 불일치가 없더라도 심하게 축 방향으로 기울어져 있음을 보여주며, 이는 축 방향 캘리브레이션에 적합하지 않음을 시사한다.

ABSTRACT

Accurate distance measurement in 3D confocal microscopy is important for quantitative analysis, volume visualization and image restoration. However, axial distances can be distorted by both the point spread function and by a refractive-index mismatch between the sample and immersion liquid, which are difficult to separate. Additionally, accurate calibration of the axial distances in confocal microscopy remains cumbersome, although several high-end methods exist. In this paper we present two methods to calibrate axial distances in 3D confocal microscopy that are both accurate and easily implemented. With these methods, we measured axial scaling factors as a function of refractive-index mismatch for high-aperture confocal microscopy imaging. We found that our scaling factors are almost completely linearly dependent on refractive index and that they were in good agreement with theoretical predictions that take the full vectorial properties of light into account. There was however a strong deviation with the theoretical predictions using (high-angle) geometrical optics, which predict much lower scaling factors. As an illustration, we measured the point-spread-function of a point-scanning confocal microscope and showed that an index-matched, micron-sized spherical object is still significantly elongated due to this PSF, which confirms that single micron-sized spheres are not well suited to determine accurate axial calibration nor axial scaling.

연구 동기 및 목표

• 표본과 침지 매질 간의 굴절률(RI) 불일치와 점확산함수(PSF) 왜곡으로 인한 공형 현미경에서의 축 방향 거리 측정 오차 문제를 해결한다.
• 일반적으로 번거롭거나 정밀도가 떨어지는 기존의 축 방향 캘리브레이션 방법의 한계를 극복한다.
• 고 NA 공형 현미경에서 일상적으로 사용 가능한 실험적으로 검증된 실용적인 캘리브레이션 기법을 제공한다.
• 기하광학 예측과는 대비하여 실험적 축 방향 스케일링 인자와 벡터성 빛 이론 예측 간의 괴리 원인을 명확히 한다.
• 미세구 입자가 RI 불일치 없이도 PSF에 의해 축 방향으로 기울어지므로 축 방향 캘리브레이션에 적합하지 않음을 입증한다.

제안 방법

• 맞춤형 유리 커버슬립 기반 캘리브레이션 세포를 제작하고, 투과 스펙트럼 내에서 파르티-페로르 간섭 무늬를 이용해 하중을 1μm 이내 정밀도로 정확히 측정한다.
• 굴절률(1.3–1.5) 범위에서 다양한 RI가 일치하는 용매에 형광 염료를 첨가하여 세포를 채운다. 이를 통해 다양한 굴절률에서 축 방향 거리를 영상 촬영한다.
• 간섭 무늬에서 측정한 축 방향 스케일링 인자를 이용해 오일 침지 목표렌즈(NA = 1.4)에서 굴절률에 따른 축 방향 거리 왜곡을 함수로 도출한다.
• 큰(약 50 µm 지름) 형광 코팅을 가진 미세구를 두 번째 캘리브레이션 방법으로 활용하며, 얇은 형광 코팅을 통해 내부 산란를 최소화하고 축 방향 측정 정확도를 높인다.
• 축 방향 캘리브레이션 전에 표준 캘리브레이션 격자를 사용해 횡방향 캘리브레이션을 수행하여 횡방향 해상도를 정확히 확보한다.
• 실험적 축 방향 스케일링 인자를 벡터광학(Shedding & Török, 1997)과 기하광학(Visser 등, 1992) 이론 예측과 비교하여 각 모델의 타당성을 평가한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 고 NA 공형 현미경에서 표본과 침지 매질 간의 굴절률 불일치에 따라 축 방향 스케일링 인자는 어떻게 변화하는가?
• RQ2 실험적 축 방향 캘리브레이션 결과는 벡터성 빛 전파 기반 이론 모델과 기하광학 기반 이론 모델 중 어느 정도 일치하는가?
• RQ3 미세구 입자는 신뢰할 수 있게 축 방향 거리 캘리브레이션에 사용될 수 있는가, 아니면 RI 불일치가 없더라도 PSF에 의해 그 모양이 기울어지는가?
• RQ4 어떤 실용적이고 정확하며 쉽게 적용 가능한 방법이 공형 현미경에서 축 방향 거리를 캘리브레이션하는 데 사용될 수 있는가?
• RQ5 축 방향 PSF는 미세입자의 실제 형태에 어떤 영향을 미치며, 3차원 영상 촬영과 캘리브레이션에 어떤 함의를 갖는가?

주요 결과

• 공형 현미경에서의 축 방향 스케일링 인자는 1.3–1.5 범위의 굴절률에서 거의 선형적으로 의존하며, 이 범위에서의 경험적 캘리브레이션 가능성을 제공한다.
• 실험적 축 방향 스케일링 인자는 전체 전자기장 성질을 고려한 벡터성 빛 이론(Sheppard & Török, 1997)과 잘 일치하지만, 기하광학 기반 예측과는 크게 다름.
• 기하광학 모델은 축 방향 스케일링 인자를 크게 과소평가하며, 관측된 값의 최대 3배까지 낮게 예측하여 고 NA 시스템에 적용 불가능함을 시사한다.
• 굴절률 불일치가 없더라도 1 µm 형광 구는 현미경의 고유한 PSF로 인해 축 방향으로 심하게 기울어져 있으며, 이는 그러한 입자가 축 방향 캘리브레이션에 적합하지 않음을 보여준다.
• 유리 세포 내 파르티-페로르 간섭 방법은 축 방향 거리의 매우 정확한 직접 측정을 가능하게 하여 다양한 굴절률에서 정밀한 캘리브레이션을 가능하게 한다.
• 큰(약 50 µm) 형광 코팅을 가진 미세구는 얇은 형광 코팅으로 인해 내부 산란가 최소화되어 축 방향 거리 측정이 정확하므로 효과적인 캘리브레이션 입자로 기능한다.