[논문 리뷰] Mutations on COVID-19 diagnostic targets

Rui Wang, Yuta Hozumi외 2명|arXiv (Cornell University)|2020. 05. 05.

SARS-CoV-2 and COVID-19 Research참고 문헌 7인용 수 7

한 줄 요약

이 연구는 2020년 5월 1일까지 수집된 7,818개의 SARS-CoV-2 게놈을 분석하여, 현재 사용 중인 진단 타겟에서 광범위한 돌연변이가 발생하고 있음을 밝혀냈다. 특히 핵단백질(N) 유전자 프라이머와 프로브에서 두드러진다. 연구 결과, N 유전자 내의 돌연변이—특히 N-China-F 시약에서의 돌연변이—가 세계적 진단 정확도를 저해하여, 향후 진단, 백신, 치료제 개발을 위해 더 보존된 바이러스 유전자를 우선적으로 고려해야 한다는 점을 시사한다.

ABSTRACT

Effective, sensitive, and reliable diagnostic reagents are of paramount importance for combating the ongoing coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic at a time there is no preventive vaccine nor specific drug available for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). It would be an absolute tragedy if currently used diagnostic reagents are undermined in any manner. Based on the genotyping of 7818 SARS-CoV-2 genome samples collected up to May 1, 2020, we reveal that essentially all of the current COVID-19 diagnostic targets have had mutations. We further show that SARS-CoV-2 has the most devastating mutations on the targets of various nucleocapsid (N) gene primers and probes, which have been unfortunately used by countries around the world to diagnose COVID-19. Our findings explain what has seriously gone wrong with a specific diagnostic reagent made in China. To understand whether SARS-CoV-2 genes have mutated unevenly, we have computed the mutation ratio and mutation $h$-index of all SARS-CoV genes, indicating that the N gene is the most non-conservative gene in the SARS-CoV-2 genome. Our findings enable researchers to target the most conservative SARS-CoV-2 genes and proteins for the design and development of COVID-19 diagnostic reagents, preventive vaccines, and therapeutic medicines.

연구 동기 및 목표

• 현재 사용 중인 진단 시약, 특히 N 유전자를 표적으로 삼는 것에 대한 SARS-CoV-2 돌연변이의 영향을 평가하기 위해.
• 진단 신뢰성에 영향을 미치는 돌연변이에 가장 취약한 바이러스 유전자 및 단백질을 특정하기 위해.
• CDC 및 WHO의 진단 프라이머 및 프로브 세트를 포함한 널리 사용되는 진단 시약 세트의 새로운 바이러스 변종 하에서의 성능을 평가하기 위해.
• 향후 진단, 백신, 치료제 개발을 안내하기 위해 보존성에 따라 SARS-CoV-2 유전자를 순위화한 목록을 제공하기 위해.
• 특정 중국산 진단 키트의 실패 원인을 그들의 목표 영역에서의 높은 돌연변이 빈도와 연결하여 설명하기 위해.

제안 방법

• GISAID에서 2020년 1월 5일부터 5월 1일까지 수집된 7,818개의 완전한 SARS-CoV-2 게놈 시퀀스를 확보하였다.
• 클러스터 오메가를 사용하여 다중 서열 정렬을 수행하여, 우한 참조 주형(NC_004718) 대비 단일염기다형성(SNPs)을 식별하였다.
• SNP 프로파일의 자카르 거리 기반으로 유전자가 5개의 별도된 하위집단(클러스터 I–V)으로 분류되도록 k-means 클러스터링을 적용하였다.
• 유전자별 돌연변이 비율(SNPs per gene length)을 계산하고, 돌연변이 빈도와 집합성을 측정하기 위해 새로운 돌연변이 h-지수를 도입하였다.
• 모든 5,117개의 식별된 SNPs를 41개의 일반적으로 사용되는 진단 프라이머 및 프로브 세트에 매핑하여 돌연변이 빈도와 타겟 결합에 미치는 영향을 평가하였다.
• 통계 분석을 통해 바이러스 유전자 간 돌연변이 패atters를 비교하고, 진단 시약 성능과의 상관관계를 분석하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 현재 진단 프라이머 및 프로브에 표적으로 삼는 SARS-CoV-2 유전자에서 돌연변이가 얼마나 퍼져 있는가?
• RQ2 어느 SARS-CoV-2 유전자가 가장 높은 돌연변이 빈도를 보이며, 따라서 진단 타겟으로 가장 부적합한가?
• RQ3 특히 N-China-F 시약에서의 핵단백질(N) 유전자 돌연변이가 특정 진단 키트의 비효율성에 얼마나 기여하는가?
• RQ4 돌연변이 h-지수 및 돌연변이 비율 지표가 백신 및 치료제 개발을 위한 가장 보존된 바이러스 유전자를 신뢰성 있게 식별하는 데 유용한가?
• RQ5 돌연변이의 분포 및 빈도는 다양한 세계 지역과 바이러스 계통 간에 어떻게 다를까?

주요 결과

• 7,818개의 SARS-CoV-2 게놈에서 총 5,117개의 단일염기다형성(SNPs)이 식별되었으며, 돌연변이는 모든 바이러스 유전자에 분포되어 있었다.
• 핵단백질(N) 유전자가 가장 높은 돌연변이 비율(0.2705)과 가장 큰 돌연변이 h-지수(29)를 보이며, 가장 비보존적이며 돌연변이에 가장 취약한 유전자임을 나타냈다.
• 중국에서 사용된 N-China-F 진단 시약은 모든 5개의 바이러스 클러스터에서 8개의 돌연변이를 보였으며, 임상 검사에서 보고된 비효율성의 원인으로 설명된다.
• 글로벌로 널리 사용되는 CDC의 N1 및 N2 프라이머/프로브 세트 역시 돌연변이의 영향을 크게 받고 있어, RT-PCR 진단의 신뢰성에 위협을 가하고 있다.
• ORF3a 및 ORF8 단백질은 각각 두 번째로 높은 돌연변이 비율(0.2800 및 0.2479)을 보이며, 높은 변동성을 보이고 있음을 나타냈다.
• N 유전자 내 높은 돌연변이 빈도와 이로 인한 프라이머/프로브 불일치는 세계적 진단 검사 노력에 심각한 영향을 미쳤으며, 진단 및 백신 개발을 위한 타겟 선택 재고가 필수적임을 시사한다.