[论文解读] Spectro-temporal encoded Multiphoton Microscopy

Sebastian Karpf, Carson T. Riche+6 more|arXiv (Cornell University)|Sep 2, 2017

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques参考文献 46被引用 12

一句话总结

本文提出一种光谱-时间编码的多光子显微镜，通过使用脉冲调制、波长扫频激光和角度色散实现无惯性光束扫描，从而在无需机械扫描延迟的情况下实现千赫兹帧率，实现了每秒8800万像素的荧光寿命成像。该系统可实现衍射极限、多模态双光子荧光及荧光寿命成像（FLIM），适用于图像辅助细胞分选等高速、高通量成像应用。

ABSTRACT

Two-Photon Microscopy has become an invaluable tool for biological and medical research, providing high sensitivity, molecular specificity, inherent three-dimensional sub-cellular resolution and deep tissue penetration. In terms of imaging speeds, however, mechanical scanners still limit the acquisition rates to typically 10-100 frames per second. Here we present a high-speed non-linear microscope achieving kilohertz frame rates by employing pulse-modulated, rapidly wavelength-swept lasers and inertia-free beam steering through angular dispersion. In combination with a high bandwidth, single-photon sensitive detector, we achieve recording of fluorescent lifetimes at unprecedented speeds of 88 million pixels per second. We show diffraction-limited, multi-modal, Two-Photon fluorescence and fluorescence lifetime (FLIM), microscopy and imaging flow cytometry with a digitally reconfigurable laser, imaging system and data acquisition system. These unprecedented speeds should enable high-speed and high-throughput image-assisted cell sorting.

研究动机与目标

• 为克服传统双光子显微镜受机械扫描器限制而速度受限的问题，后者通常帧率仅在10–100帧每秒之间。
• 实现面向先进生物应用（如图像辅助细胞分选）的高速、高通量成像。
• 开发一种系统，可在前所未有的采集速度下实现衍射极限、多模态双光子荧光及荧光寿命成像（FLIM）。
• 集成数字可重构激光源、成像系统与数据采集流水线，实现灵活、高带宽的运行。

提出的方法

• 利用脉冲调制、快速波长扫频激光，生成超快、光谱编码的激发脉冲。
• 采用角度色散实现无惯性光束扫描，消除机械扫描延迟。
• 集成高带宽、单光子敏感探测器，以实现高时间分辨率的荧光信号捕获。
• 应用光谱-时间编码技术，将空间与光谱信息在时间和波长维度上复用。
• 采用数字可重构系统架构，支持激光参数、成像模式与数据采集设置的动态调节。
• 结合波长扫频激发与时间分辨检测，实现在高帧率下的荧光寿命测量。

实验结果

研究问题

• RQ1 光谱-时间编码与波长扫频激光是否能够突破机械扫描限制，在多光子显微镜中实现千赫兹帧率？
• RQ2 该方法在荧光寿命成像中可实现的最高像素采集速率是多少？
• RQ3 该系统是否能在实现多模态双光子荧光与FLIM成像的同时保持衍射极限分辨率？
• RQ4 无惯性光束扫描机制与传统旋转镜扫描器相比，在成像速度与稳定性方面有何提升？
• RQ5 该系统在多样的成像任务与高通量应用中，其数字可重构能力在多大程度上得以实现？

主要发现

• 该系统实现了每秒8800万像素的荧光寿命成像速度，显著超越传统极限。
• 通过角度色散实现无惯性光束扫描，成功实现了千赫兹帧率，消除了机械扫描延迟。
• 实现了衍射极限、多模态双光子荧光与荧光寿命成像（FLIM），具有高灵敏度与分子特异性。
• 通过结合快速扫描与高带宽检测，实现了高通量成像流式细胞术。
• 数字可重构的激光源、成像系统与数据采集系统可灵活适配多种生物成像任务。
• 该方法支持高速、高灵敏度与高分辨率成像，适用于图像辅助细胞分选应用。