[논문 리뷰] Structured illumination microscopy for dual-modality 3D sub-diffraction resolution fluorescence and refractive-index reconstruction

Shwetadwip Chowdhury, Will J. Eldridge외 2명|arXiv (Cornell University)|2017. 08. 15.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 71인용 수 43

한 줄 요약

이 논문은 구조화된 조명(SI) 현미경 시스템을 제시하며, 산란 없는 초해상 분辨 현미경 기술과 간섭형 합성 입구 현미경을 융합하여 삼차원 이중 모달리티의 초분해능 영상 분석을 실현한다. 이 방법은 살아있는 세포 내에서 분자 형광과 생물물리적 굴절률(RI) 분포를 동시에 정량적으로 시각화할 수 있으며, F-actin 염색을 한 A549 및 HT-29 세포를 대상으로 각 모달리티에서 100 nm 이하의 초해상 분辨을 입증한다.

ABSTRACT

Though structured illumination (SI) microscopy is a popular imaging technique conventionally associated with fluorescent super-resolution, recent works have suggested its applicability towards sub-diffraction coherent imaging with quantitative endogenous biological contrast. Here, we demonstrate that SI can efficiently integrate the principles of fluorescent super-resolution and coherent synthetic aperture to achieve 3D dual-modality sub-diffraction resolution, fluorescence and refractive-index (RI) visualizations of biological samples. Such a demonstration can enable future biological studies to synergistically explore molecular and biophysical/biochemical mechanisms at sub-diffraction resolutions. We experimentally demonstrate this framework by introducing a SI microscope capable of 3D sub-diffraction fluorescence and RI imaging, and verify its biological visualization capabilities by experimentally reconstructing 3D RI/fluorescence visualizations of fluorescent calibration microspheres as well as alveolar basal epithelial adenocarcinoma (A549) and human colorectal adenocarcinmoa (HT-29) cells, fluorescently stained for F-actin.

연구 동기 및 목표

• 형광 초해상 분辨과 간섭형 합성 입구 현미경을 융합하여, 분자적 및 생물물리적 모달리티에서 동시에 3차원 초분해능 영상 촬영이 가능한 단일 광학 플랫폼을 개발하는 것.
• 기존 초해상 기술이 분자 특이적 형광 또는 내재된 생물물리적 대비에 국한되어 있는 한계를 극복하는 것.
• 분자적 구조(형광을 통해)와 생물물리적 성질(굴절률을 통해)을 초분해능에서 동시에 시각화함으로써 상호보완적인 생물학적 통찰을 제공하는 것.
• 플라스티크 미세입자 및 형광 표지된 암세포주(A549, HT-29)를 포함한 생물 샘플을 이용하여 프레임워크의 타당성을 검증하는 것.

제안 방법

• 시스템은 다수의 각도에서 조명 패턴을 조절하는 구조화된 조명(SI)을 사용하여, 향상된 공간 주파수 성분을 확보하기 위해 합성 입구 합성을 실현한다.
• 간섭형 SI를 사용하여 프리즘 간섭도 분석(DT) 기반으로 3차원 정량적 위상(QP) 및 굴절률(RI)을 재구성하며, 프리즘 커널을 사용한 디지털 전파 기법을 활용한다.
• 형광 초해상 분辨은 표준 SI 현미경 원리를 활용하여, 고주파 정보를 초광학 분해능 한계를 넘어서기 위해 다수의 패턴 조명을 사용해 이동 및 복원하는 방식이다.
• 형광 영상의 강도 검출과 간섭형 영상의 복소 전기장 검출을 동시에 수행함으로써, 단일 촬영 시퀀스에서 양 모달리티의 공동 재구성을 가능하게 한다.
• 형광 및 간섭형 영상의 3차원 전송 함수(TF)를 모델링하여, 수치적 입구율(NA), 파장 및 탐지 각도에 기반한 횡방향 및 축방향 해상도의 한계를 정의한다.
• 재구성 알고리즘은 반복적 위상 회복 및 역필터링을 사용하여 기록된 강도 패턴에서 고해상도 RI 및 형광 분포를 복원한다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 구조화된 조명 현미경을 활용하여 형광 및 굴절률 영상에서 동시에 초분해능 분辨을 달성할 수 있는가?
• RQ2 합성 입구 현미경과 형광 초해상 분辨을 융합함으로써 생물 샘플의 이중 모달리티 3차원 영상 촬영이 어떻게 가능해지는가?
• RQ3 굴절률(RI) 재구성 기술이 물리적 두께와 광경로 길이(OPL)를 얼마나 잘 분리하여, 정량적 위상 영상만으로는 볼 수 없는 생물학적으로 의미 있는 구조적 세부 정보를 드러내는가?
• RQ4 특히 세포 사멸 과정에서 형광 및 굴절률 분포는 어떻게 상관관계를 가지는가?
• RQ5 동일한 광학 시스템과 촬영 프로토콜이 분자적(형광) 및 생물물리적(굴절률) 매개변수에 대해 동시에 정량적이고 초분해능 영상 데이터를 제공할 수 있는가?

주요 결과

• 시스템은 형광 및 굴절률 영상에서 모두 3차원 초분해능 분辨을 달성하였으며, 두 모달리티 모두 횡방향 해상도가 100 nm 이하였다.
• 재구성된 RI 맵은 A549 세포에서 세포핵 및 핵소보다 물리적 두께가 훨씬 작은 고굴절률 지역을 드러내었으며, 이는 유사한 광경로 길이를 가짐에도 불구하고 의미 있는 생물학적 의미를 지닌다.
• 정량적 위상 영상만으로는 고굴절률에 의한 높은 OPL과 두꺼운 두께에 의한 높은 OPL을 구분할 수 없었지만, RI 재구성 기술은 이 두 요소를 고유하게 분리하였다.
• HT-29 세포에서는 세포막의 볼브 및 고굴절률 지역의 증가가 세포 사멸과 관련이 있음을 RI 및 형광 영상로 확인하였다.
• 형광 영상에서는 볼브 부근에서 질서가 깨진 F-actin 세 cytoskeleton을 관찰하였고, RI 영상에서는 조밀하고 고굴절률의 구조를 확인하여 이중 모달리티가 서로 보완적인 구조적 통찰을 제공함을 입증하였다.
• 동일한 세포주 내에서도 세포 간의 RI 분포에 다양성이 관찰되어, 정량적 영상 연구에서 인구 수준의 통계 분석이 필수적임을 시사하였다.