[논문 리뷰] Tracking of individual freely diffusing fluorescent protein molecules in the bacterial cytoplasm

Brian P. English, Arash Sanamrad외 3명|arXiv (Cornell University)|2010. 03. 10.

Advanced Fluorescence Microscopy Techniques참고 문헌 28인용 수 5

한 줄 요약

이 연구는 생체세포 내에서 개별 mEos2 형광 단백질 분자를 추적하기 위해 스트로보스코픽 레이저 자극과 확률적 광활성화를 조합한 초해상도 영상 기법을 개발하였다. 이는 13.1 ± 1.2 μm²/s의 정상 확산을 보이며, 박테리아 내 세포내 역학에 대한 단일 분자 연구의 기초를 마련한다.

ABSTRACT

We combine stroboscopic laser excitation with stochastic photoactivation and super-resolution fluorescence imaging. This makes it possible to record hundreds of diffusion trajectories of small protein molecules in single bacterial cells with millisecond time resolution and sub-diffraction limited spatial precision. We conclude that the small protein mEos2 exhibits normal diffusion in the bacterial cytoplasm with a diffusion coefficient of 13.1 -+ 1.2 μm^2 s^(-1). This investigation lays the groundwork for studying single-molecule binding and dissociation events for a wide range of intracellular processes.

연구 동기 및 목표

• 생체 박테리아 세포 내에서 자유롭게 확산하는 단일 형광 단백질을 고해상도로 실시간으로 추적할 수 있도록 하기 위해.
• 밀도가 높은 세포 내 환경에서 단일 분자 역학을 해석하는 데 있어 전통적 형광 현미경의 한계를 극복하기 위해.
• 밀리초 시간 해상도와 보다 낮은 분해능을 초과하는 공간 해상도로 박테리아 세포질 내에서 작은 단백질의 확산 행동을 정량화하기 위해.
• 세포 내 과정에서 단일 분자 결합 및 해리 사건을 연구하기 위한 견고한 플랫폼을 구축하기 위해.
• 단일 분자 영상 기법을 사용하여 원핵세포 내 분자 이동성 분 析를 위한 정량적 프레임워크를 제공하기 위해.

제안 방법

• 형광 단백질의 활성화를 시간적으로 제어하기 위해 스트로보스코픽 레이저 자극을 사용하였다.
• 확률적 광활성화를 초해상도 형광 영상 기법과 융합하여 개별 분자를 분리하고 추적하였다.
• mEos2의 확산 궤적을 실시간으로 기록하기 위해 밀리초 시간 해상도의 시간 간격 영상 촬영을 수행하였다.
• 단일 형광 분자의 정확한 국소화를 위해 분해능 이하의 공간 정밀도를 적용하였다.
• 노이즈가 많은 배경에서 개별 분자 궤적을 추출하고 분석하기 위해 영상 처리 기법을 구현하였다.
• 추적된 궤적의 평균 제곱이동(MSD) 분석을 통해 확산 계수를 계산하였다.

실험 결과

연구 질문

• RQ1 어떤 방식으로 작은 형광 단백질이 혼잡한 박테리아 세포질 내에서 확산되는가?
• RQ2 실시간 생체 박테리아 세포 내에서 밀리초 시간 해상도와 분해능 이하의 공간 해상도로 단일 분자 추적을 수행할 수 있는가?
• RQ3 mEos2의 확산 계수는 점성이 높은 세포 내 환경에서 자유 확산에 대한 이론적 예측과 비교해 어떻게 다른가?
• RQ4 박테리아 세포질은 작은 단백질의 이동을 어느 정도 제한하거나 촉진하는가?
• RQ5 확률적 광활성화와 스트로보스코픽 자극이 실시간 생체 세포 내에서 개별 분자의 신뢰할 수 있는 장기 추적을 가능하게 하는가?

주요 결과

• 개별 mEos2 분자는 박테리아 세포질 내에서 정상(브라운 운동) 확산을 나타낸다.
• 단일 분자 추적 기법을 통해 mEos2의 확산 계수를 13.1 ± 1.2 μm²/s로 매우 정밀하게 측정하였다.
• 밀리초 시간 해상도로 수백 개의 개별 확산 궤적을 기록하는 데 성공하였다.
• 분해능 이하의 공간 정밀도를 확보하여 단일 형광 분자의 정확한 국소화가 가능하였다.
• 이 기법은 단일 분자 수준에서 일시적인 결합 및 해리 사건을 연구하는 데 적합하다.
• 결과는 mEos2가 실시간 생체 박테리아 내에서 단일 분자 역학 연구에 신뢰할 수 있는 형광 프로브로 사용될 수 있음을 검증한다.