[論文レビュー] 3D Snapshot Microscopy of Extended Objects

Xiang Huang, Alan Selewa+12 more|arXiv (Cornell University)|Feb 5, 2018

Integrated Circuits and Semiconductor Failure Analysis参考文献 24被引用数 3

ひとこと要約

本稿では、多焦点顕微鏡法（MFM）とスパarsityに基づく再構成を用いた3次元スナップショット顕微鏡法を提案する。この手法により、25 Hzの速度で、共焦点顕微鏡と同等のボリューム分解能を達成し、動的で広がりのある蛍光対象（例：細菌）を捉えることが可能となる。1枚のカメラフレームに25の焦点面での深度情報を符号化し、圧縮センシングフレームワークを活用することで、逐次走査を必要とせず、高速かつ高精度の3次元イメージングを実現。生物学的動的プロセスのリアルタイム研究が可能となる。

ABSTRACT

Volumetric biological imaging often involves compromising high temporal resolution at the expense of high spatial resolution when popular scanning methods are used to capture 3D information. We introduce an integrated experimental and image reconstruction method for capturing dynamic 3D fluorescent extended objects as a series of synchronously measured 3D snapshots taken at the frame rate of the imaging camera. We employ multifocal microscopy (MFM) to simultaneously image at 25 focal planes and process this depth-encoded image to recover the 3D structure of extended objects, such as bacteria, using a sparsity-based reconstruction approach. The combined experimental and computational method produces image quality similar to confocal microscopy in a fraction of the acquisition time. In addition, our computational image reconstruction approach allows a simplified MFM optical design by correcting aberrations using the measured response to point sources. This "compressive" MFM acquisition and reconstruction method, where an image volume with roughly 8 million voxels is recovered from a single 1-megapixel captured image, enables straightforward study of dynamic processes in 3D, and as a simultaneous snapshot advances the state of the art in dynamic 3D microscopy.

研究の動機と目的

• 従来の3次元顕微鏡における時間的・空間的トレードオフを克服すること。特に、逐次走査による時間分解能の制限を解消すること。
• 点源仮定を必要とせず、広がりのある蛍光生物学的対象（例：細菌）を高速かつ高精度で3次元的にイメージングすること。
• スパarsityの事前知識を用いて、1枚の2次元MFMスナップショットから3次元構造を再構成する計算フレームワークを開発すること。
• 点拡散関数（PSF）の測定値を用いて歪みを補正することで、複雑な光学部品に依存しないMFM光学設計の簡素化を図ること。
• 1台のカメラによるスナップショット取得により、ライブバイオロジカルサンプルの3次元動的挙動をリアルタイムで追跡できることを実証すること。

提案手法

• 分光的光学素子（DOE）を用いて、顕微鏡の対物レンズからの光を25の空間的に別個の、深度に符号化された部分像に分割。これらは1枚のEMCCD検出器上に形成され、それぞれが異なる焦点面に対応する。
• 測定されたMFM画像とシステムの前方モデルとの差を最小化するスパarsityに基づく最適化フレームワークを用いて、3次元ボリューム再構成を実行する。
• 前方モデルは、3次元オブジェクトボリュームを、深度に応じた点拡散関数（PSF）で畳み込み、各z面ごとにその対応する2次元PSFタイルで畳み込み、その結果を合算して予測されたMFM画像を形成する。
• 再構成は、PSFのサンプリングとzステップサイズに一致する108 nm × 108 nm × 50 nmのボクセルにオブジェクトボリュームを離散化し、強度と勾配の大きさにおけるスパarsityを強制することで、逆問題の安定化を図る。
• DOEに起因する色収差はPSFモデルに組み込み、追加の光学補正素子を必要とせずに、計算的に歪みを補正可能である。
• 50 nmのz間隔で点光源から実験的に測定したPSFを用いて、システム応答をキャリブレーションし、広がりのあるオブジェクトの正確な再構成を可能にする。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 1枚のカメラスナップショット取得により、動的で広がりのある蛍光対象を、ビデオレートの速度で3次元ボリュームイメージングできるか？
• RQ2 スパarsityに基づく再構成は、細菌のような広がりのあるオブジェクトの詳細な3次元蛍光分布を、1枚のMFMスナップショットから回復できるか？
• RQ3 単純なDOEが引き起こす歪みを、複雑な光学部品を用いずに、計算的にどれほど補正できるか？
• RQ4 スナップショットMFM法の再構成品質は、共焦点顕微鏡と比較して、分解能および信号忠実度の面でどの程度優れているか？
• RQ5 本スナップショット手法を用いて、細菌の拡散や回転といった動的3次元プロセスを、リアルタイムで信頼性高く追跡できるか？

主な発見

• 本手法は、1枚の100万画素のMFM画像から、広がりのあるオブジェクトの3次元ボリューム再構成を実現。共焦点顕微鏡と同等の画像品質で約800万ボクセルを回復した。
• 1枚のMFMスナップショットから再構成された細菌の3次元ボリュームは、共焦点参照ボリュームと比較してピーク信号対雑音比（PSNR）が47.33 dBに達した。
• 本手法により、25 Hzの高速3次元イメージングが実現され、カメラフレームレートに制限されるのみで、細菌の拡散や回転といった3次元プロセスのリアルタイム観察が可能となった。
• 50フレーム（1.2秒）にわたる細菌の重心の再構成軌道は、x, y, z方向で正確な追跡が可能であり、細菌が3次元空間を移動する際の高度と方位角の変化が明確に観察された。
• 本手法は、細菌の微細構造的特徴を解像し、極部に位置する2つの蛍光濃度ラobeを、横方向で100 nm未満、軸方向で50 nmの分解能で明確に特定した。
• 共焦点顕微鏡による細菌の強度および勾配の大きさの累積分布関数（CDF）は、スパarsity事前知識の有効性を裏付け、スパース信号に一致する重尾分布を示した。