[論文レビュー] 4D Liquid-phase Electron Microscopy of Ferritin by Brownian Single Particle Analysis

Gabriele Marchello, Cesare De Pace+3 more|arXiv (Cornell University)|Jul 7, 2019

Advanced Electron Microscopy Techniques and Applications参考文献 30被引用数 5

ひとこと要約

本論文は、4D液体相電子顕微鏡を対象として、ブラウン運動の単粒子平均を用いたブラウン運動単粒子解析（BSPA）を導入し、液体中でのフェリチン動態を、単粒子平均によるブラウン運動を用いてリアルタイムで追跡可能にした。収集時間は、凍結電子顕微鏡（cryo-EM）の数時間から数秒に短縮され、構造的変化、水和ダイナミクス、熱的揺らぎを捉えることができ、動的構造生物学の基盤を確立した。

ABSTRACT

Protein function and activity are a consequence of its three-dimensional structure. Single particle analysis of cryogenic electron micrographs has radically changed structural biology allowing atomic reconstruction of almost any type of proteins. While such an approach provides snapshots of three-dimensional structural information that can be correlated with function, the new frontier of protein structural biology is in the fourth dimension, time. Here we propose the use of liquid phase electron microscopy to expand structural biology into dynamic studies. We apply here single particle analysis algorithm to images of proteins in Brownian motion through time; thus, Brownian single particle analysis (BSPA). BSPA enables to reduce the acquisition time from hours, in cryo-EM, to seconds and achieve information on conformational changes, hydration dynamics, and effects of thermal fluctuations. Yielding all these previously neglected aspects, BSPA may lead to the verge of a new field: dynamic structural biology.

研究の動機と目的

• タンパク質内の動的過程を捉えることで、構造生物学を第4の次元、すなわち時間へと拡張すること。
• 収集時間に数時間を要する凍結電子顕微鏡（cryo-EM）の限界を克服すること。
• 凍結を伴わずに溶液中でのタンパク質を高速で時間分解能をもってイメージングする手法を開発すること。
• ブラウン運動、熱的揺らぎ、水和がタンパク質構造および動態に与える影響を調査すること。
• 液体相電子顕微鏡を用いた動的構造生物学の新しいフレームワークを確立すること。

提案手法

• 液体相電子顕微鏡（LP-EM）を用いて、水溶液中でのフェリチン粒子をリアルタイムでイメージングする。
• ブラウン運動を経験するタンパク質の画像に単粒子解析（SPA）を適用し、各フレームを異なる方位またはコンformationのスナップショットとして扱う。
• 時間経過にわたる個々の粒子画像の計算的アライメントと平均化により、信号対雑音比を向上させる。
• 溶液中での粒子の自然な拡散および回転を活用し、迅速に多数のコンformationをサンプリングする。
• 時間分解能データを統合して、3次元構造＋時間発展という4次元構造情報を再構成する。
• 統計解析を用いて、一時的な粒子画像から構造的変化、水和殻ダイナミクス、熱的揺らぎに関する情報を抽出する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 液体相電子顕微鏡においてブラウン運動を経験するタンパク質に対して、単粒子解析をどのように適合させれば動的構造情報を抽出できるか。
• RQ2 本手法は、凍結電子顕微鏡（cryo-EM）と比較して、時間分解能および構造的忠実度をどの程度達成できるか。
• RQ3 熱的揺らぎおよび水和ダイナミクスが、フェリチン粒子における観察された構造的不均一性にどのように影響を与えるか。
• RQ4 本手法を用いて、フェリチンの構造的変化をリアルタイムで解像できるか。
• RQ5 動的構造研究におけるコンformationサンプリングのソースとしてブラウン運動を用いる際の利点と制限は何か。

主な発見

• BSPAにより、収集時間を凍結電子顕微鏡（cryo-EM）の数時間から数秒に短縮し、タンパク質の動的挙動をリアルタイムで観察可能となった。
• 本手法は、熱的揺らぎおよびブラウン運動に起因するフェリチン粒子の構造的変化を成功裏に捉えた。
• 粒子画像の時間分解能に伴う構造的変化を通じて、フェリチンまわりの水和ダイナミクスが観察可能となった。
• 急速な運動および低電子線量にもかかわらず、構造解析に十分な信号対雑音比が得られた。
• 4次元再構成により、静的凍結電子顕微鏡研究では通常見逃されがちな一時的な構造状態が明らかになった。
• BSPAは、自然なブラウン運動を動的構造生物学におけるコンformationサンプリングのソースとして用いる可能性を示した。