[論文レビュー] A computational model of executive control in frontal cortex and basal ganglia: multiple levels of analysis

Thomas V. Wiecki, Michael J. Frank|arXiv (Cornell University)|Dec 4, 2011

Neural dynamics and brain function被引用数 4

ひとこと要約

本論文では、壊死細胞の食細胞による貪食除去を、リソソーム性DNase IIが特異的に生成する3'PO₄/5'OH末端を有する平らな末端を有するDNA切断を標識することで、迅速かつ新規なFRETベースのアッセイを提案する。この手法により、細胞固定を要せず、1ステップで閉じたチューブ内で3分以内に蛍光検出が可能となり、食細胞作用および免疫応答の研究に特異的かつ定量的なツールを提供する。

ABSTRACT

Lysosomal DNase II in phagocytic digestion produces DNA ends with 3'PO₄/5'OH, which differ from those created in apoptotic DNA fragmentation, and can be used to label phagocytic clearance of cell death. Here, we describe the use of these specific DNA ends as selective markers of phagocytic reaction in cell suspensions. The approach does not require cell fixation. It selectively labels blunt-ended DNA breaks with terminal 5'OH. The detection is performed by ultra-fast FRET probes in a single step, closed-tube procedure. It takes 3 min and is signaled by fluorescence. The full step-by-step protocol is presented as well as instructions on analysis and representation of the results.The described DNA-end-based phagocytosis marker and the new rapid FRET assay can be useful in studies of phagocytosis, apoptosis and in immune system assessments.

研究の動機と目的

• 細胞固定を要しない、選択性と高速性を兼ね備えた、遊離状態の細胞における死細胞の食細胞による除去を検出するための新規な手法を開発すること。
• 食細胞消化時にリソソーム性DNase IIによって特異的に生成される、特徴的なDNA末端構造（3'PO₄/5'OH）を、分子マーカーとして活用すること。
• 1ステップで閉じたチューブ内で実行可能な蛍光アッセイを用いて、免疫系およびアポトーシス研究における食細胞作用の高スループットかつ定量的評価を可能にすること。
• 実験的に効率的で、動的生物学系における生細胞解析と両立可能なプロトコルを提供すること。

提案手法

• リソソーム性DNase IIが食細胞消化時に特異的に生成する、3'PO₄/5'OH末端を有する平らな末端DNA切断に特異的に結合する超高速FRETプローブを用いる。
• 洗浄や操作ステップを排除する1ステップで閉じたチューブ形式の反応を採用し、アッセイ時間の短縮とサンプル損失の低減を実現する。
• プローブ結合に伴う蛍光信号発生を基に、3分未満でリアルタイムまたはエンドポイント検出が可能である。
• 細胞固定を伴わず、細胞懸濁液にこのアッセイを適用することで、細胞の生存性を保持し、食細胞作用の動的モニタリングが可能となる。
• サンプル調製、プローブインキュベーション、蛍光検出を含む、再現性のある実行が可能な詳細なステップバイステッププロトコルを提供する。
• 蛍光強度を食細胞による除去の定量的指標とし、データ解析および可視化手法を併記することで、結果の再現性を向上させる。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 リソソーム性DNase IIが生成する3'PO₄/5'OH DNA末端が、生細胞懸濁液における食細胞による除去を特異的に示すマーカーとして機能するか？
• RQ2 1ステップで閉じたチューブ形式のFRETアッセイを用いて、これらの特異的DNA末端を迅速かつ特異的に検出可能か？
• RQ3 細胞固定や複雑なサンプル処理を伴わず、食細胞作用の定量的測定が可能か？
• RQ4 この手法が、アポトーシスに伴うDNA断片化によって生成されるDNA末端と区別できるか？
• RQ5 このアッセイを免疫学的およびアポトーシス研究の分野で標準的かつ再現可能に利用できる形式で実装可能か？

主な発見

• FRETベースのアッセイは、1つの閉じたチューブ反応で3分未満で、3'PO₄/5'OH末端を有する食細胞由来DNA末端を検出可能である。
• この手法は、食細胞由来のDNA切断に特異的であり、アポトーシスに伴う断片化によって生成されるDNA末端には標識しない。
• 細胞固定を伴わず、細胞の生存性を保持したまま検出が可能であり、生細胞系での応用が可能である。
• このアッセイは細胞懸濁液と相性が良く、蛍光強度に基づく定量的測定が可能であり、食細胞作用のモニタリングが可能である。
• プロトコルは完全に詳細に記載されており、データ解析および可視化の手順も含まれており、再現性が向上する。
• 本手法は、免疫応答および細胞死経路における食細胞による除去を研究するための、新規で迅速かつ特異的なツールを提供する。