[論文レビュー] A watershed-based algorithm to segment and classify cells in fluorescence microscopy images

Lena R. Bartell, Lawrence J. Bonassar+1 more|arXiv (Cornell University)|Jun 2, 2017

Cell Image Analysis Techniques参考文献 1被引用数 4

ひとこと要約

本論文は、蛍光顕微鏡画像における細胞の自動分離および分類のための使いやすく、GUIベースのウォータッシュド分離アルゴリズムを提示する。前処理、マーカー誘導型ウォータッシュド分離、しきい値ベースの分類を統合することで、精度が高く再現性のある結果が得られた。手動による検証と受信者操作特性（ROC）解析による最適なパrameterチューニングにより、分類しきい値が1.2の時点で95％の正確性を示した。

ABSTRACT

Imaging assays of cellular function, especially those using fluorescent stains, are ubiquitous in the biological and medical sciences. Despite advances in computer vision, such images are often analyzed using only manual or rudimentary automated processes. Watershed-based segmentation is an effective technique for identifying objects in images; it outperforms commonly used image analysis methods, but requires familiarity with computer-vision techniques to be applied successfully. In this report, we present and implement a watershed-based image analysis and classification algorithm in a GUI, enabling a broad set of users to easily understand the algorithm and adjust the parameters to their specific needs. As an example, we implement this algorithm to find and classify cells in a complex imaging assay for mitochondrial function. In a second example, we demonstrate a workflow using manual comparisons and receiver operator characteristics to optimize the algorithm parameters for finding live and dead cells in a standard viability assay. Overall, this watershed-based algorithm is more advanced than traditional thresholding and can produce optimized, automated results. By incorporating associated pre-processing steps in the GUI, the algorithm is also easily adjusted, rendering it user-friendly.

研究の動機と目的

• コンピュータビジョンの専門知識のないバイオメディカル研究者にとって利用可能な、高度な画像解析ツールの不足に対処すること。
• 蛍光顕微鏡画像からの細胞定量における手動バイアスを低減し、処理速度を向上させること。
• 事前処理とマーカー誘導により、過剰分離を防ぐ透明で調整可能なウォータッシュドベースの分離パイプラインを構築すること。
• 手動による検証と受信者操作特性（ROC）解析を用いて、分離および分類のパラメータを最適化すること。
• 前処理、分離、後処理を統合した、自由に利用可能なMATLABベースのGUIツールを提供すること。

提案手法

• ウォータッシュド分離の前段階として、ノイズ低減とコントラスト向上のためのガウスフィルタリングとメディアンフィルタリングを適用する。
• 局所的な強度最大値に基づく領域最小値を定義することで、マーカー制御型ウォータッシュド分離を用い、過剰分離を防止する。
• 一貫した分離を確保するため、背景強調ステップを実施する。
• サイズのしきい値に基づき、小規模で不審なオブジェクトを除去するため、分離結果を後処理する。
• 赤色と緑色チャンネルの平均蛍光強度を用いた比関数 f = mean(R)/mean(G) を用いて細胞を分類する。
• 100個の細胞を手動でラベル付けしたサブセットを用いたROC解析により、真陽性率と真陰性率を最大化する最適な分類しきい値を特定する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）を用いることで、ウォータッシュドベースの分離アルゴリズムをコンピュータビジョンの専門知識のないバイオメディカル研究者にも利用可能にすることができるか？
• RQ2 事前処理とマーカー誘導は、複雑な蛍光顕微鏡画像におけるウォータッシュド分離の精度を向上させ、過剰分離を低減するのにどの程度有効か？
• RQ3 2色のバイアビリティアッセイにおいて、強度比分析を用いた場合、生存細胞と死細胞を分類する最適なしきい値は何か？
• RQ4 ROCで最適化されたパラメータチューニングは、手動またはしきい値のみの手法と比較して、分類精度をどの程度向上させるか？
• RQ5 分離、分類、検証を統合した一元化された、ユーザーが調整可能なパイプラインを開発することは可能か？

主な発見

• GUIベースのウォータッシュドアルゴリズムは、特に重なり合う細胞が多数存在する複雑な画像において、従来のしきい値ベースの手法よりも顕著に分離精度を向上させた。
• ガウスフィルタリング（σ = 1.5）、メディアンフィルタリング（カーネルサイズ = 5）およびバックグラウンド強調の組み合わせにより、最適な分離が達成され、誤検出が低減された。
• バイアビリティアッセイにおいて、分類関数 f = mean(R)/mean(G) は、しきい値1.2で最大の正確性を示した。ROC解析による100個の手動ラベル付きサブセットの分析結果、95％の正確性が得られた。
• 本手法は、非連続的な染色パターンを示す3色のミトコンドリア機能アッセイにおいても、細胞の分離および分類に成功し、非連続なパターンに対しても頑健であることが確認された。
• 前処理、分離、後処理の各ステップを1つのGUIに統合することで、ユーザーはスクリプトを書かずにパラメータを繰り返し調整し、最適な結果を得られるようになった。
• 手動による比較と統計解析を通じた検証により、本アルゴリズムの信頼性が確認され、高スループットな自動画像解析に適していることが示された。