[論文レビュー] Antimalarial Artefenomel Inhibits Human SARS-CoV-2 Replication in Cells while Suppressing the Receptor ACE2

Tania Massignan, Alberto Boldrini+11 more|arXiv (Cornell University)|Apr 28, 2020

SARS-CoV-2 and COVID-19 Research参考文献 34被引用数 8

ひとこと要約

本研究では、PPI-FITと呼ばれる新しい手法（アセトアルデヒド中間体を標的にする）により、ACE2の発現を抑制することで、ヒト細胞におけるSARS-CoV-2の増殖を強力に阻害する薬剤としてアーテフェノメル（抗マラリア薬）を同定した。アーテフェノメルは、SARS-CoV-2（MEX-BC2/2020系統）の感染に起因する細胞障害性効果を完全に防ぎ、COVID-19治療への再利用可能性を示す強力な抗ウイルス活性を示した。

ABSTRACT

The steep climbing of victims caused by the new coronavirus disease 2019 (COVID-19) throughout the planet is sparking an unprecedented effort to identify effective therapeutic regimens to tackle the pandemic. The SARS-CoV-2 virus is known to gain entry into various cell types through the binding of one of its surface proteins (spike) to the host Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ACE2). Thus, spike-ACE2 interaction represents a major target for vaccines and antiviral drugs. A novel method has been recently described by some of the authors to pharmacologically downregulate the expression of target proteins at the post-translational level. This technology builds on computational advancements in the simulation of folding mechanisms to rationally block protein expression by targeting folding intermediates, hence hampering the folding process. Here, we report the all-atom simulations of the entire sequence of events underlying the folding pathway of ACE2. Our data revealed the existence of a folding intermediate showing two druggable pockets hidden in the native conformation. Both pockets were targeted by a virtual screening repurposing campaign aimed at quickly identifying drugs capable to decrease the expression of ACE2. We identified four compounds capable of lowering ACE2 expression in Vero cells in a dose-dependent fashion. All these molecules were found to inhibit the entry into cells of a pseudotyped retrovirus exposing the SARS-CoV-2 spike protein. Importantly, the antiviral activity has been tested against live SARS-CoV-2 (MEX-BC2/2020 strain). One of the selected drugs (Artefenomel) could completely prevent cytopathic effects induced by the presence of the virus, thus showing antiviral activity against SARS-CoV-2. Ongoing studies are further evaluating the possibility of repurposing these drugs for the treatment of COVID-19.

研究の動機と目的

• ヒト細胞へのSARS-CoV-2の侵入を遮断するためにACE2発現を低下させられる再利用可能な薬剤を同定すること。
• ACE2の折りたたみ中間体を標的にするPPI-FIT法を応用し、完全な消失を伴わずにACE2レベルを低下させる化合物を同定すること。
• Vero細胞を用いた生SARS-CoV-2に対する同定された化合物の抗ウイルス効果を評価すること。
• 細胞傷害性および擬似ウイルス侵入系を用いたアッセイにより、候補薬の安全性および特異性を評価すること。

提案手法

• ACE2の完全な折りたたみ経路を再構築するために、全原子分子動力学シミュレーションを実施し、一時的な折りたたみ中間体を同定した。
• ACE2の折りたたみ中間体内に、通常の構造では見えないが、リガンド結合が可能な2つの薬剤感受性のくぼみを同定した。
• これらのくぼみを用いたバーチャルスクリーニングを実施し、中間体を安定化させ、分解を促進する可能性のある既存薬の再利用を試みた。
• SARS-CoV-2スパイクタンパク質を発現する擬似レトロウイルス系を用いて、Vero細胞でのウイルス侵入阻害を評価した。
• 中和赤インキ法を用いて、生SARS-CoV-2（MEX-BC2/2020系統）に対する抗ウイルス活性を評価し、細胞障害性効果および細胞生存率を測定した。
• 用量反応および細胞傷害性アッセイを実施し、候補化合物のIC50値および選択性インデックスを算出した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 PPI-FIT法は、ACE2の折りたたみ中間体を標的にすることで、選択的にACE2発現を低下させる小分子を同定できるか？
• RQ2 同定された化合物は、Vero細胞への擬似SARS-CoV-2スパイクタンパク質媒介侵入を阻害するか？
• RQ3 アーテフェノメルは、in vitroで生SARS-CoV-2に対して顕著な抗ウイルス活性を示すか？
• RQ4 アーテフェノメルの抗ウイルス効果は、有効濃度で特異的かつ非細胞傷害的か？
• RQ5 既存薬は、全身的有害性を引き起こさずにACE2のダウンレギュレーションによってSARS-CoV-2の侵入を阻害できるか？

主な発見

• 全原子シミュレーションにより、通常の構造には見えないが、薬剤感受性のくぼみを有するACE2の折りたたみ中間体が同定された。
• バーチャルスクリーニングにより、Vero細胞におけるACE2発現が用量依存的に低下する4つの化合物（ジプラジジン、ブクロジン、ベクラブビル、アーテフェノメル）が同定された。
• 4つの化合物すべてが、Vero細胞への擬似SARS-CoV-2スパイクタンパク質媒介侵入を阻害し、ウイルス侵入の干渉を示した。
• アーテフェノメルは、Vero細胞において生SARS-CoV-2（MEX-BC2/2020系統）に起因する細胞障害性効果を完全に防ぎ、ウイルス増殖の完全阻害を示した。
• 細胞傷害性アッセイでは、有効な抗ウイルス濃度で顕著な細胞死が認められず、良好な治療窓が示された。
• 生存率アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比は29倍であり、アッセイの高い耐久性と信頼性が確認された。