[論文レビュー] Antioxidant activity and toxicity study of cerium oxide nanoparticles stabilized with innovative functional copolymers

Geoffroy Goujon, Victor Baldim+10 more|arXiv (Cornell University)|Apr 7, 2021

Advanced Nanomaterials in Catalysis参考文献 84被引用数 48

ひとこと要約

本研究では、酸化セリウムナノ粒子（CNPs）を、強力な表面結合を可能にするホスホン酸と、生体適合性を向上させるPEGまたはアミン末尾PTEGを有する革新的機能性コポリマーでコーティングしたものが開発された。このCNPsは、神経血管内皮細胞（bEnd.3）において、安定性が向上し、触媒的抗酸化活性が保持され、細胞毒性を示さないことが示された。CNPsはグルタメート誘発性のROSおよびミトコンドリアスーパーオキサイドを効果的に低減し、マウスにおける毒性は認められなかった。本研究は、虚血性ストロークに起因する血管障害の治療に有望な候補であることを示している。

ABSTRACT

Oxidative stress, which is one of the main harmful mechanisms of pathologies including is-chemic stroke, contributes to both neurons and endothelial cell damages, leading to vascular lesions. Although many antioxidants have been tested in preclinical studies, no treatment is currently available for stroke patients. Since cerium oxide nanoparticles (CNPs) exhibit remarkable antioxidant capacities, our objective is to develop an innovative coating to enhance CNPs biocompatibility without disrupting their antioxidant capacities or enhance their toxicity. This study reports the synthesis and characterization of functional polymers and their impact on the enzyme-like catalytic activity of CNPs. To study the toxicity and the antioxidant properties of CNPs for stroke and particularly endothelial damages, in vitro studies are conducted on a cerebral endothelial cell line (bEnd.3). Despite their internalization in bEnd.3 cells, coated CNPs are devoid of cytotoxicity. Microscopy studies report an intracellular localization of CNPs, more precisely in endosomes. All CNPs reduces glutamate-induced intracellular production of ROS in endothelial cells but one CNP significantly reduces both the production of mitochondrial super-oxide anion and DNA oxidation. In vivo studies report a lack of toxicity in mice. This study there-fore describes and identifies biocompatible CNPs with interesting antioxidant properties for ischemic stroke and related pathologies.

研究の動機と目的

• 虚血性ストローク治療を目的とした、生体適合性が高く、安定的で、抗酸化活性が保持された酸化セリウムナノ粒子（CNPs）の開発。
• モノヌクレアーファージョウシステムによるクリアランスを低減するため、ホスホン酸-PEGコポリマーを用いた新規なポリマー被膜の設計と合成。
• bEnd.3脳内皮細胞における、コーティングされたCNPsのin vitroでの細胞毒性、細胞内取り込みおよび細胞内局在の評価。
• マウスにおける静脈内投与後の、in vivoでの毒性および生体分布の評価。
• 機能性CNPsが、特にミトコンドリアROSおよびDNA酸化を含む、内皮細胞における酸化的ストレスを軽減できるかの検証。

提案手法

• 酸性pH下での硝酸セリウムの熱水解を用いたCNPsの合成、その後、TEM、DLS、XPS、WAXS、UV-Vis分光法を用いた特性評価。
• ポリ(methyl methacrylate)骨格を有する統計コポリマーの設計および合成。ホスホン酸（金属結合用）およびPEGまたはアミン末尾PTEG（ステルス効果および機能化用）を共valently架橋。
• 機能性コポリマーを用いたCNPsのコーティングにより、コロイド的安定性および生体適合性の向上。
• DPPHアッセイおよびヒドロキシルラジカル scavenging テストを用いた、in vitroでの触媒的抗酸化活性の評価。
• bEnd.3細胞を用いたin vitro研究により、細胞毒性（MTTアッセイ）、ROS産生（DCFH-DA蛍光）および細胞内局在（Cy5標識CNPsを用いた共焦点顕微鏡法）の評価。
• マウスにおけるin vivo生体分布および毒性研究として、尾静脈注射によるCNPs投与後、臓器における蛍光分析および肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳の組織像評価。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 機能性コポリマー被膜は、抗酸化活性を損なわせることなく、酸化セリウムナノ粒子のコロイド的安定性および生体適合性を向上させることができるか？
• RQ2 ポリマー被膜CNPsは、グルタメート誘発ストレス下における脳内皮細胞における酸化的ストレス、特にミトコンドリアスーパーオキサイドおよびDNA酸化を低減するか？
• RQ3 コーティングされたCNPsのbEnd.3細胞内での細胞内動態および局在は何か。また、その取り込みは細胞毒性と関連しているか？
• RQ4 コーティングされたCNPsは、体内で長期的に安定しており、良好な薬物動態を示すか？
• RQ5 マウスへの静脈内投与後、全身的毒性または臓器への蓄積が認められるか？

主な発見

• コーティングされたCNPsは、水動的直径9.8 nmおよび14%のCe3+分率を示し、触媒的活性に不可欠な混合価状態を示している。
• DPPHアッセイにより、強力な抗酸化能力が確認され、IC50値は効果的なラジカル scavenging 活性を示している。
• すべてのコーティングされたCNPsは、bEnd.3細胞におけるグルタメート誘発性の細胞内ROSを低減した。特に1つのフォーミュレーション（CeO2@P3）は、ミトコンドリアスーパーオキサイドおよびDNA酸化の両方を顕著に低減した。
• 共焦点顕微鏡による観察で、CNPsの細胞内取り込みは主にエンドソームに局在していることが判明。bEnd.3細胞では有意な細胞毒性は認められなかった。
• in vivo研究では、投与後24時間および1か月後に、肝臓、腎臓、脾臓、肺、脳に有意な組織像の変化や血液検査の異常は認められなかった。
• 生体分布解析から、蛍光信号が時間経過とともに持続的に臓器に保持されており、特に重要な臓器への蓄積は認められず、低毒性であり、治療的応用の可能性を支持する結果となった。