[論文レビュー] Antiproliferative MCR peptides block physical interaction of insulin with retinoblastoma protein (RB) in human lung cancer cells

Razvan T. Radulescu, Kai Kehe|ArXiv.org|Jun 13, 2007

Cancer-related Molecular Pathways参考文献 8被引用数 12

ひとこと要約

本研究では、特にMCR-4およびMCR-10を含む細胞増殖抑制性MCRペプチドが、ヒト非小細胞肺癌細胞A549においてインスリンと網様芽腫瘍抑制性タンパク質（RB）の物理的相互作用を破壊することを示した。磁性ビーズを用いた免疫沈降法により、研究者たちはこれらの細胞でインスリン-RBヘテロダイマーの形成を確認し、MCRペプチドがこの複合体を特異的に阻害することを示した。これにより、インスリン-RB相互作用ががん治療の標的として有効であることが裏付けられた。

ABSTRACT

Fifteen years ago, a structural analysis of the hormone insulin and the retinoblastoma tumor suppressor protein (RB) revealed that they may physically interact with one another. Subsequently, an RB peptide corresponding to the proposed RB binding site for insulin was found to recognize full-length insulin in vitro. As part of efforts aimed at developing this RB peptide into an anti-cancer drug, this molecule was chemically coupled to a cellular internalization signal and termed "MCR peptide". Meanwhile, several such MCR peptide variants have been demonstrated to restrain the proliferation of different human cancer cells in vitro and in vivo. Moreover, one of the MCR peptides coined MCR-10 was shown to be capable of interfering with the complex formation between insulin and RB in HepG2 human hepatoma cells, as monitored by immunofluorescence. This latter result indicating an in vivo association between insulin and RB was confirmed by a follow-up study combining the methods of co-immunoprecipitation and immunoblotting. Here, we provide evidence for the existence of the insulin-RB complex in A549 human non-small cell lung cancer cells. Specifically, we demonstrate this heterodimer by means of a magnetic beads-based immunoprecipitation approach and equally show that this dimer can be disrupted by MCR-4 or MCR-10 each of which is known to possess antiproliferative properties, yet to a much lesser extent by a control peptide. Thus, this investigation has yielded another important proof for the occurrence of the insulin-RB dimer and, furthermore, its validity as a target for antineoplastic MCR peptides.

研究の動機と目的

• ヒト肺がん細胞においてインスリンと網様芽腫瘍抑制性タンパク質（RB）が物理的に相互作用するかどうかを調査すること。
• 細胞増殖抑制性MCRペプチドがA549細胞におけるインスリン-RB複合体を破壊できるかどうかを特定すること。
• MCRペプチドを用いた抗がん療法の機能的標的にして、インスリン-RBジマーが有効であることを検証すること。
• MCR-4、MCR-10、および対照ペプチドのインスリン-RB相互作用の破壊能を比較すること。

提案手法

• 磁性ビーズを用いた免疫沈降法により、ヒト肺がん細胞A549でインスリン-RBヘテロダイマーを精製および検出した。
• 共沈降法およびインディオブロット法を用いて、インスリンとRBの物理的結合を確認した。
• 既に細胞増殖抑制効果が示されたMCR-4およびMCR-10ペプチドが、インスリン-RB複合体の破壊能力を有するかテストした。
• 細胞増殖抑制活性を示さない対照ペプチドを、特異性を評価するための陰性対照として用いた。
• A549細胞の細胞質抽出物をMCRペプチドまたは対照物質で処理後、インスリンおよびRBの発現をプローブした。
• 処理群間でのインスリン-RB複合体の存在を定量し、比較した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 ヒト非小細胞肺癌細胞A549において、インスリンと網様芽腫瘍抑制性タンパク質（RB）の物理的相互作用が生じるか？
• RQ2 MCR-4またはMCR-10ペプチドがA549細胞におけるインスリン-RB複合体を破壊できるか？
• RQ3 インスリン-RB複合体の破壊は、活性を示すMCRペプチドに特異的であり、対照ペプチドとは異なるか？
• RQ4 インスリン-RB相互作用の破壊は、肺がん細胞における細胞増殖抑制効果と相関するか？

主な発見

• 磁性ビーズを用いた免疫沈降法により、ヒト肺がん細胞A549でインスリン-RBヘテロダイマーが有意に精製され、確認された。
• MCR-10およびMCR-4ペプチドは、インスリン-RB複合体の破壊に顕著な効果を示し、相互作用への直接的な干渉を示唆した。
• 対照ペプチドはインスリン-RB複合体を破壊しなかったため、MCRペプチドの特異性が裏付けられた。
• 本研究は、肝芽腫細胞からの先行研究を拡張し、肺がん細胞にインスリン-RBジマーが存在することを直接的証明した。
• 結果として、MCRペプチドを用いた抗がん療法において、インスリン-RB相互作用が機能的標的になることが検証された。