[論文レビュー] Bright and fast voltage reporters across the visible spectrum via electrochromic FRET (eFRET)

Peng Zou, Yongxin Zhao+7 more|arXiv (Cornell University)|Mar 18, 2014

Photoreceptor and optogenetics research参考文献 33被引用数 5

ひとこと要約

本論文では、電気色性Förster共振エネルギー移動（eFRET）に基づく遺伝子的にコードされた膜電位イメージングシステムを提示している。電位感受性ロドプシンドメインが付着した蛍光タンパク質の蛍光クエンチングを制御することで、可視光域全域にわたる明るく高速な膜電位レポーターを実現した。本システムは100 mVあたり6–10% ΔF/Fの感度とミリ秒未塔の応答時間を有し、ニューロンにおける高SNRのマルチカラー膜電位イメージングを可能にした。

ABSTRACT

We present a palette of brightly fluorescent genetically encoded voltage indicators (GEVIs) with excitation and emission peaks spanning the visible spectrum, sensitivities from 6 - 10% Delta F/F per 100 mV, and half-maximal response times from 1 - 7 ms. A fluorescent protein is fused to an Archaerhodopsin-derived voltage sensor. Voltage-induced shifts in the absorption spectrum of the rhodopsin lead to voltage-dependent nonradiative quenching of the appended fluorescent protein. Through a library screen, we identified linkers and fluorescent protein combinations which reported neuronal action potentials in cultured rat hippocampal neurons with a single-trial signal-to-noise ratio from 6.6 to 11.6 in a 1 kHz imaging bandwidth at modest illumination intensity. The freedom to choose a voltage indicator from an array of colors facilitates multicolor voltage imaging, as well as combination with other optical reporters and optogenetic actuators.

研究の動機と目的

• 可視光域にわたるスペクトルをカバーする遺伝子的にコードされた膜電位インジケーター（GEVI）のパレットを開発すること。
• 高い感度（100 mVあたり6–10% ΔF/F）と高速応答時間（7 ms未塔）を達成し、動作電位の信頼性の高い検出を可能にすること。
• 色の多様性により、オプトジェネティクスツールや他の光学的レポーターと併用可能な互換性を確保すること。
• 生きたニューロンにおける頑健な膜電位レポーティングを実現するための最適な蛍光タンパク質およびリンクャーの組み合わせを同定すること。

提案手法

• アーカエロールドプシン由来の電位感受性ロドプシンを蛍光タンパク質に融合し、eFRETシステムを構築した。
• ロドプシンの電位依存的スペクトルシフトを利用して、フォトサーファスの非放射的エネルギー移動を制御した。
• 明るさ、感度、応答キネティクスを最適化するため、蛍光タンパク質-リンクャー融合体のライブラリをスクリーニングした。
• in vitroおよび培養ラット海馬ニューロンにおいて、電位依存的蛍光クエンチングを測定した。
• 生理的照明条件下での信号対雑音比（SNR）を評価するために、1 kHzのイメージング帯域幅を用いた。
• in vivo応用に適した最適な構築体を、SNR、応答時間、スペクトル特性に基づいて選定した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 単一のeFRETプラットフォームが、可視光域全域にわたる調整可能な励起および発光を有する膜電位レポーターを生成可能か？
• RQ2 膜電位センシングにおいて、高い感度と高速応答を実現するための最適な蛍光タンパク質およびリンクャーの組み合わせは何か？
• RQ3 これらのレポーターは、生きたニューロンにおいて、1回の動作電位を高SNRで解像可能か？
• RQ4 このeFRETパレットを用いて、どの程度のマルチカラー膜電位イメージングが達成可能か？
• RQ5 照明強度が、これらのレポーターによる動作電位の検出可能性にどのように影響するか？

主な発見

• eFRETシステムは、可視光域にわたる励起および発光最大波長を有する膜電位レポーターを生成した。
• 感度は100 mVあたり6%から10% ΔF/Fの範囲にあり、膜電位変化の強力な検出を可能にした。
• 応答時間は最短で1 msであり、すべての構築体が最大応答の半分に達するまでの時間が7 ms以内であった。
• 培養ラット海馬ニューロンでは、1 kHzのイメージング帯域幅下で、1回の試行におけるSNRが6.6から11.6の範囲にあった。
• スペクトル的に異なるレポーターの存在により、マルチカラー膜電位イメージングが可能になった。
• 最適な構築体は、やや低い照明条件下でも高い性能を維持し、生細胞イメージングに適していた。