[論文レビュー] Calculating the contribution of different binding modes to Quinacrine - DNA complex formation from polarized fluorescence data

Igor Voloshin, Olga Ryazanova+2 more|arXiv (Cornell University)|Nov 25, 2013

DNA and Nucleic Acid Chemistry参考文献 1被引用数 3

ひとこと要約

本研究では、リン酸-染料比（P/D）とイオン強度を変化させた条件下で、ニワトリ赤血球DNAに対するクイナクリン（QA）の埋め込み結合と静電的結合モードの寄与を偏光フラーレスセンス法を用いて定量的に行った。電気的結合は弱いが、結合サイトサイズが埋め込み結合よりも8倍小さいため、低P/D条件下で支配的であることが判明した。また、複雑な形成を定量的にパラメータ化する手法を提示し、フラーレスセンス滴定データから結合モードの寄与を分離可能であることを示した。

ABSTRACT

Binding of acridine derivative quinacrine (QA) to chicken erythrocyte DNA was studied by methods of absorption and polarized fluorescent spectroscopy. Measurements were carried out in aqueous buffered solutions (pH 6.9) of different dye concentrations (QA concentration range from $10^{-6}$ till $10^{-4}$ M) and ionic strengths ($Na^{+}$ concentration rang from $10^{-3}$ till 0.15 M) in a wide range of phosphate-to-dye molar ratios ($P/D$). It is established that the minimum of fluorescent titration curve plotted as relative fluorescence intensity $vs$ $P/D$ is conditioned by the competition between the two types of QA binding to DNA which posses by different emission parameters: (i) intercalative one dominating under high $P/D$ values, and (ii) outside electrostatic binding dominating under low $P/D$ values, which is accompanied by the formation of non-fluorescent dye associates on the DNA backbone. Absorption and fluorescent characteristics of complexes formed were determined. The method of calculation of different binding modes contribution to the complex formation depending on $P/D$ value is presented. It was shown that the size of binding site measured as the number of DNA base pairs per one QA molecule bound in the case of the electrostatic interaction is 8 times less than that for the intercalative one that determines the competitive ability of the outside binding against the stronger intercalative binding mode.

研究の動機と目的

• 異なるイオン強度およびP/D比の下で、クイナクリン（QA）のDNAに対する埋め込み結合と静電的結合モードの相対的寄与を特定すること。
• 偏光フラーレスセンス法を用いて、2種類の異なるQA-DNA結合モードの競合を解明すること。
• DNA-リガンド複合体形成過程における各結合モードの寄与割合を定量的に計算するための手法を開発すること。
• 埋め込み結合と静電的結合モードのそれぞれの結合サイトサイズを測定・比較すること。
• 静電的結合に伴いDNA上に非発光性の染料アソシエートが形成されることで、発光強度および極性がどのように変化するかを特定すること。

提案手法

• 偏光フラーレスセンス法を用いて、P/Dモル比およびイオン強度の関数としての相対的発光強度およびアナリスティー（anisotropy）を測定した。
• QA濃度を10⁻⁶ Mから10⁻⁴ M、Na⁺濃度を10⁻³ Mから0.15 Mの範囲で変化させ、吸光度および発光滴定曲線を記録した。
• 数学的モデルを適用し、高P/Dにおける埋め込み結合（高P/D）と低P/Dにおける静電的結合（低P/D）への発光応答を分離した。
• 本手法は、静電的結合に伴いDNA上に非発光性の染料アソシエートが形成され、発光が消光されることを考慮している。
• 独立的かつ非協同的結合を仮定したモデルに滴定データをフィッティングすることで、結合サイトサイズを算出した。
• 発光アナリスティーおよび強度データを用いて、P/D比の関数として各結合モードが総複合体形成に寄与する割合を定量した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 異なるP/Dモル比において、クイナクリン-DNA複合体形成に寄与する埋め込み結合と静電的結合モードの相対的寄与は何か？
• RQ2 イオン強度は、埋め込み結合と静電的結合モードの間の競合にどのように影響するか？
• RQ3 各モードの結合サイトサイズは何か？ また、それらは、低い親和性にもかかわらず静電的結合が優位に働く理由を説明するか？
• RQ4 DNA上に非発光性の染料アソシエートが形成されることで、静電的結合時の観測発光強度にどのような影響が生じるか？
• RQ5 偏光フラーレスセンスデータを用いて、DNA-リガンド系における複数の結合モードの寄与を定量的に分離できるか？

主な発見

• 相対的発光強度対P/D滴定曲線に観察される最小値は、高P/Dで支配的となる埋め込み結合と低P/Dで支配的となる静電的結合との間の競合に起因する。
• 静電的結合に伴い、DNAの骨格上に非発光性の染料アソシエートが形成され、これが発光を消光させ、滴定曲線における観測最小値に寄与している。
• 静電的結合の結合サイトサイズは、埋め込み結合のそれよりも8倍小さいため、弱い親和性にもかかわらず低P/D条件下で競合優位となる理由が説明できる。
• 低P/D比において、静電的結合の総複合体形成への寄与は、埋め込み結合を上回っている。これは、埋め込み結合の内因性親和性がより高いにもかかわらずである。
• 提示された手法により、P/D比の関数として各結合モードの寄与割合を定量的に計算可能であり、詳細な熱力学的および動力学的解析が可能となる。
• 本研究では、適切なモデリングを組み合わせることで、発光アナリスティーおよび強度データを用いてDNA-リガンド系における複数の結合モードを解明できることが示された。