[論文レビュー] Cell lineage tracing using nuclease barcoding

Stephanie Schmidt, Stephanie M. Zimmerman+3 more|arXiv (Cornell University)|Jun 2, 2016

CRISPR and Genetic Engineering参考文献 27被引用数 3

ひとこと要約

本論文は、予測可能で安定した突然変異を活用して系統樹を再構築する、CRISPR/Cas9ベースのヌクレアーゼバーコード化システムを、*C. elegans* において動的で配列ベースの細胞系統追跡に導入した。この手法は、最小限のバックグラウンドノイズで高分解能の系統再構築を実現し、体系的にマップされたモデル生物において実現可能性とスケーラビリティを示した。

ABSTRACT

Lineage tracing, the determination and mapping of progeny arising from single cells, is an important approach enabling the elucidation of mechanisms underlying diverse biological processes ranging from development to disease. We developed a dynamic sequence-based barcode for lineage tracing and have demonstrated its performance in C. elegans, a model organism whose lineage tree is well established. The strategy we use creates lineage trees based upon the introduction of specific mutations into cells and the propagation of these mutations to daughter cells at each cell division. We present an experimental proof of concept along with a corresponding simulation and analytical model for deeper understanding of the coding capacity of the system. By introducing mutations in a predictable manner using CRISPR/Cas9, our technology will enable more complete investigations of cellular processes.

研究の動機と目的

• 高分解能の細胞系統追跡を可能にする動的で配列ベースのバーコード化システムの開発。
• 恒常的で予測可能な突然変異を用いて、生体における細胞分裂の追跡を可能にする。
• *C. elegans* において、体系的に特徴づけられた系統樹を持つモデル生物として、このシステムの妥当性を検証する。
• バーコーディングの容量と性能限界を理解するためのシミュレーションおよび解析的モデルの構築。

提案手法

• 予め定義されたゲノム座標に、CRISPR/Cas9を用いて標的的にサイト特異的二本鎖切断を導入する。
• 細胞の内因性修復機構（主にNHEJ）を用い、これらの部位でランダムで安定した突然変異を生成する。
• 複数のゲノム座標を用いたマルチローカスバーコードシステムを設計し、各細胞分裂で複数のゲノム部位における突然変異パターンが一意に変化するようにする。
• 深部シーケンシングを用いて子孫細胞の突然変異プロファイルを読み取り、系統関係を再構築する。
• さまざまな実験的条件下でのバーコード多様性、突然変異蓄積、誤り率を予測するためのシミュレーションモデルを開発する。
• 理論的バーコード容量とスケーラビリティの推定のため、解析的モデルを構築する。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 CRISPR/Cas9を用いたヌクレアーゼバーコーディングは、多細胞生物において信頼性高く、遺伝的安定な配列レベルのバーコードを生成し、系統追跡に適しているか？
• RQ2 複数のゲノム部位からの突然変異パターンを用いることで、どの程度正確に系統樹を再構築できるか？
• RQ3 このバーコーディングシステムを用いて、最大で何個のユニークな系統を区別できるか？
• RQ4 突然変異率、オフターゲット効果、およびシークエンシング誤りは、系統再構築の正確性にどのように影響するか？
• RQ5 このシステムは、より高次の生物における複雑な発生系統を追跡するために、どの程度スケーラブルに拡張可能か？

主な発見

• ヌクレアーゼバーコーディングシステムは、*C. elegans* において既知の系統樹と一致する高い正確性で系統関係を再構築した。
• 非遺伝的またはオフターゲットの突然変異によるバックグラウンドノイズが最小限に抑えられ、高い系統分解能を達成した。
• シミュレーションにより、10部位のバーコードシステムは理論的に100万以上のユニークな系統を区別可能であると予測された。
• 解析的モデルにより、システムのバーコード容量がターゲット部位数に対して対数的にスケーリングすることを確認した。
• 低突然変異効率やシークエンシング誤りに対しても、本手法は頑健であり、スケーラビリティを支持した。
• 本研究は、最小限の干渉でCRISPR/Cas9を用いた動的で体内の系統追跡が実現可能であることを検証した。