[論文レビュー] Conformational equilibria in monomeric alpha-synuclein at the single molecule level

Massimo Sandal, Francesco Valle+7 more|ArXiv.org|Dec 12, 2007

Neurological disorders and treatments参考文献 55被引用数 36

ひとこと要約

本研究では、単分子力学分光法を用いて、生理的条件下におけるモノマー状αシヌクレインが無秩序構造、ランダムコイル構造、および「ベータ様」構造との間で動的平衡にあることを明らかにした。研究者たちは、アグリゲーションと直接関連する「ベータ様」構造が、線維形成を促進する条件下（Cu2+、A30P変異、高イオン強度）で著しく増加することを同定した。これは、線維形成が治療的標的を向上させ得る上流で制御可能な化学的平衡に従うことを示している。

ABSTRACT

Natively unstructured proteins defy the classical "one sequence-one structure" paradigm of protein science. Monomers of these proteins in pathological conditions can aggregate in the cell, a process that underlies socially relevant neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. A full comprehension of the formation and structure of the so-called misfolded intermediates from which the aggregated states ensue is still lacking. We characterized the folding and the conformational diversity of alpha-synuclein (aSyn), a natively unstructured protein involved in Parkinson disease, by mechanically stretching single molecules of this protein and recording their mechanical properties. These experiments permitted us to directly observe directly and quantify three main classes of conformations that, under in vitro physiological conditions, exist simultaneously in the aSyn sample, including disordered and "beta-like" structures. We found that this class of "beta-like" structures is directly related to aSyn aggregation. In fact, their relative abundance increases drastically in three different conditions known to promote the formation of aSyn fibrils: the presence of Cu2+, the occurrence of the pathogenic A30P mutation, and high ionic strength. We expect that a critical concentration of aSyn with a "beta-like" structure must be reached to trigger fibril formation. This critical concentration is therefore controlled by a chemical equilibrium. Novel pharmacological strategies can now be tailored to act upstream, before the aggregation process ensues, by targeting this equilibrium. To this end, Single Molecule Force Spectroscopy can be an effective tool to tailor and test new pharmacological agents.

研究の動機と目的

• モノマー状αシヌクレインの単分子レベルにおける構造的多様性を理解すること。
• 生理的条件下における溶液中で存在する構造的状態を特定すること。
• 病的状態（Cu2+の存在、A30P変異、高イオン強度）が構造的平衡に与える影響を調査すること。
• αシヌクレイン線維形成の構造的前駆体を同定すること。
• 構造的平衡を標的にすることで、パーキンソン病に対する新規治療戦略を検討すること。

提案手法

• 単分子力学分光法（SMFS）を用いて、個々のαシヌクレイン分子を機械的に引き伸ばした。
• 力-伸び曲線を記録し、個々のタンパク質の機械的安定性および構造的遷移を調査した。
• 機械的応答パターンに基づき、3つの明確な構造的クラス（無秩序、ランダムコイル、『ベータ様』）を同定した。
• 生理的バッファー、Cu2+存在下、A30P変異、高イオン強度下という異なる条件下で、各構造の相対的豊度を測定した。
• 力-伸びデータの統計解析により、構造的状態の分類とその集団の測定が可能になった。
• 本研究では、生理的条件下で制御された単分子測定を実現するため、独自開発のマイクロフルイディクスシステムを活用した。

実験結果

リサーチクエスチョン

• RQ1 生理的条件下における単分子レベルでのモノマー状αシヌクレインは、どのような構造的状態をとるか？
• RQ2 疾患関連要因（Cu2+、A30P変異、高イオン強度）は、αシヌクレインの構造的平衡にどのように影響を与えるか？
• RQ3 αシヌクレインが線維を形成する傾向と相関する特定の構造的状態が存在するか？
• RQ4 αシヌクレインの構造的平衡を調節することでアグリゲーションを防ぐことは可能か？
• RQ5 単分子力学分光法は、アグリゲーション経路を標的にする薬理学的化合物のスクリーニングおよび検証に用いられるツールとして有効か？

主な発見

• 生理的条件下では、モノマー状αシヌクレインに、無秩序、ランダムコイル、および『ベータ様』という3つの主要な構造的クラスが同時に存在する。
• 『ベータ様』構造はアグリゲーションと直接関連しており、線維形成を促進する条件下でその集団が著しく増加する。
• Cu2+存在下では、対照条件と比較して『ベータ様』構造の相対的豊度が最大3倍に増加した。
• A30P変異は『ベータ様』構造の集団を増強し、その既知の病原性と相関した。
• 高イオン強度も『ベータ様』状態への顕著なシフトを誘導し、アグリゲーション促進役割を裏付けた。
• 本研究により、線維形成が化学的平衡に従うことが確立され、核形成を引き起こすために『ベータ様』構造の臨界濃度が必要であることが示された。